補腎中藥對成骨細胞生物學功能的影響及骨橋蛋白基因表達調控的研究.pdf

1、研究背景骨質疏松癥(Osteoporosis，OP)是以全身性的骨量減少，骨結構發(fā)生退行性變，引起骨的脆性增加，骨的強度降低為特征的，多發(fā)于中老年人的代謝性疾病，是引起老年人腰腿痛、脊柱變形及骨折的主要病因。隨著年齡的增長，人體的內分泌代謝紊亂，鈣吸收功能下降等因素均可使OP發(fā)病率升高。我國逐漸步入老齡化社會的，OP患者將會越來越多，因此研究有效防治OP的藥物和方法是醫(yī)學界的熱點。 OP主要由成骨細胞(Osteoblast，OB

2、)的骨形成功能不足和破骨細胞(Osteoclast，OC)的骨吸收功能亢進引起的，破壞的骨質不能及時修復，從而導致骨質疏松。骨組織的修復通過骨重建來實現，骨重建受許多因素調節(jié)，其中非膠原蛋白在骨重建中發(fā)揮作用作用。非膠原蛋白是從礦化組織基質中分離提純的一類酸性糖蛋白，在生物礦化中起著重要的調控作用。骨橋蛋白(osteopontin，OPN)是非膠原蛋白的一種，屬于磷酸化糖蛋白，含有RGD(Arg-Gly-Asp)序列，該序列是粘附分子的

3、特有序列。含有該序列的OPN可促進骨基質形成、基質礦化和礦化結節(jié)的形成。此外，OPN可促進OC的活化，從而促進OC的骨吸收。因此，OPN在骨重建中發(fā)揮重要作用。 骨靈丸是用于治療OP的中藥復方制劑，根據中醫(yī)理論“腎藏精，主骨，生髓”，“髓者，腎精所生，精足則髓足，髓足骨內，髓足者則骨強”而組方的，Ⅰ主要有鹿茸、鹿角膠、菟絲子、骨碎補等補腎陽、強筋骨中藥組成。經過動物實驗及多年的臨床應用證實骨靈丸具有良好的抗骨質疏松作用，但骨靈丸

4、抗骨質疏松具體機制尚未清楚。鑒于OB、OPN在骨質疏松癥發(fā)生的重要作用，因此，從骨靈丸對OB的生物學功能的影響及對OPN基因表達調控來研究其抗骨質疏松機理。 研究目的1、建立分離和培養(yǎng)OB的最優(yōu)方法； 2、探討補腎中藥血清對體外培養(yǎng)的OB生物學作用的影響及OPN基因表達的調控； 3、在OB-OC共同培養(yǎng)體系中探討骨靈丸對OB部分生物學功能的影響及OPN基因表達的調控，以探討補腎中藥在不同培養(yǎng)體系中對OPND基因表

5、達的調控與礦化結節(jié)形成之間的關系。 方法1.選擇新生的SD乳鼠頭顱骨，應用改良的胰酶-膠原酶消化法分離OB，并結合骨片貼塊法培養(yǎng)OB，采用細胞的形態(tài)學、細胞酶化學方法鑒定培養(yǎng)的OB； 2、運用血清藥理學的方法對補腎中藥血清在細胞水平上抗骨質疏松機制的研究； 3.在不同的培養(yǎng)體系探討含補腎中藥血清血清對OB的生物學作用及OPN基因表達調控的研究； 4.實驗分五組：補腎中藥血清高劑量組(highdoses，H

6、D)、補腎中藥血清中劑量組(Middledoses，MD)、補腎中藥血清低劑量組(Lowdoses，LD)、空白血清對照組(Control)、陽性對照組(17-β雌二醇組，Estrol，E2)； 5.應用對硝基苯酚法、流式細胞技術、四唑鹽比色法(MTT)和茜素紅染色法對含骨靈丸血清作用OB后的堿性磷酸酶(AlkalinePhosphatase，ALP)活性、細胞周期及細胞凋亡、增殖及礦化功能進行測定； 6.運用免疫印跡(

7、Western-blot)檢測OPN表達，應用半定量RT-PCR方法對OPN的基因表達進行分析； Ⅱ7.采用SPSS10.0(R)軟件包對實驗數據進行統(tǒng)計學分析。 結果1.OB的鑒定：(1)形態(tài)學鑒定：細胞呈長梭形或三角形貼壁生長，HE染色可見細胞胞體較大，邊界清晰，胞漿呈深紅色，細胞突起的長短與數量不等，胞核偏位、呈圓或橢圓形、偶有雙核型，核染色質深、呈粗糙疏松網狀，核仁1～2個，呈藍色，初步證實此為OB； (

8、2)細胞酶化學鑒定：將細胞進行ALP染色，并運用免疫組化的方法檢測OB的I型膠原，均呈陽性反應，此為OB的特征性表現，從而進一步鑒定為OB，細胞陽性率達95％以上，提示細胞的純度較高。 2.經各種處理因素作用的體外培養(yǎng)的OB生物學供變化如下：(1)補腎中藥血清高劑量組、中劑量組和雌二醇組均可使OB的增殖率升高、細胞周期中的(G2+S)期細胞比率增加、細胞凋亡減少、細胞ALP活性增強、礦化結節(jié)形成數量增加，與空白對照組比較均有顯著

9、性差異(P＜0.01)； (2)補腎中藥血清低劑量組可促進細胞增殖、增強細胞ALP活性，與空白對照組比較具有統(tǒng)計學意義P＜0.05)； (3)雌二醇組對OB在促進細胞增殖作用比補腎中藥血清各劑量組明顯(P＜0.05)； (4)半定量RT-PCR分析OPN的基因表達結果如下：補腎中藥高劑量組、中劑量組、雌二醇組的OPN基因擴增量/β-actin擴增量OD比值與空白對照組比較升高具有顯著性差異(P＜0.01)；高劑量

10、組、中劑量組與雌二醇組之間的比較無顯著性差異(P＞0.05)，提示骨靈丸高劑量組、中劑量組與雌二醇組可促進OPN基因的表達。 3、各處理因素作用的在共育體系中的OB各指標變化如下：(1)補腎中藥高劑量組、中劑量組和雌二醇組增強ALP活性、促進OB礦化結節(jié)形成，與空白對照組比較具有顯著性差異(P＜0.01)；低劑量組與空白對照組比較增加具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；高、中劑量組和雌二醇組之間比較Ⅲ差異有顯著性(P＜0.05)。雌

11、二醇組增強ALP活性、促進礦化結節(jié)形成作用比其它各組明顯。 (2)OB的OPN基因表達：補腎中藥高劑量組、中劑量組、E2組的OPN基因的擴增量/β-actin的擴增量的OD比值與空白對照組比較升高具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)；高劑量組、中劑量組與雌二醇組之間的比較有顯著性差異(P＞0.05)，雌二醇組上調OPN基因的表達較其他各組明顯。 (3)共育體中OB的鈣結節(jié)結節(jié)數目與單獨培養(yǎng)的OB相應各組比較降低18％-25％；

12、OPN基因表達量與單獨培養(yǎng)的OB相應各組比較降低約18％-30％左右；共育體中的ALP活性比單獨培養(yǎng)的OB相應各組升高18％-25％。 結論1、利用改良的胰酶-膠原酶消化法及骨片培養(yǎng)相結合的方法成功培養(yǎng)出數量大、純度高OB，能夠滿足實驗要求的。 2、補腎中藥血清可促進OB分化成熟及礦化結節(jié)的形成，具有促進OB的骨形成功能。 3、構建OB-OC共育體系，在共育體系中骨靈丸血清具有促進OB分化及及成熟功能，并促進鈣結