氟對成骨細胞增殖及其MCM3基因表達的影響.pdf

1、我國是一個地方性氟中毒病情嚴重的國家，病的類型多，分布廣，病情重，受威脅人口多。隨著相關(guān)研究工作的深入，如果能夠從基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)多學(xué)科的角度，利用新的先進技術(shù)手段，探索對地方性氟中毒(地氟病)發(fā)病機制的認識，尤其是從分子水平闡明氟中毒發(fā)生、發(fā)展的機制，將為地氟病的防治提供新的科學(xué)理論或思路。在前期課題的基礎(chǔ)上，我們選擇了氟骨癥相關(guān)基因MCM3(minichromosome maintenance deficient 3(S. Cerevisi

2、ae))進行分子機制的實驗研究。MCM3是一種與細胞DNA復(fù)制密切相關(guān)的基因，其在細胞中含量的多少以及在細胞內(nèi)分布位置的不同可以反映細胞的生長狀態(tài)。本課題在驗證及改良小鼠成骨細胞原代培養(yǎng)常用方法的基礎(chǔ)上，測定了成骨細胞處于不同濃度氟環(huán)境、不同作用時間時氟離子在細胞內(nèi)的分布情況和濃度變化趨勢；觀察不同劑量氟作用于體外培養(yǎng)小鼠成骨細胞后其增殖情況；檢測氟對成骨細胞中MCM3蛋白表達水平的影響及mRNA分布情況；同時檢測氟對成骨細胞中MCM3

3、mRNA量的影響。 方法：(1)建立與改良小鼠成骨細胞的原代培養(yǎng)方法，并通過堿性磷酸酶和鈣結(jié)節(jié)染色方法進行細胞來源鑒定。(2)建立核磁共振波譜法檢測成骨細胞內(nèi)氟離子的方法，觀察染氟后成骨細胞中氟離子在細胞內(nèi)的分布趨勢。(3)染氟組按照劑量分為5組，即0、5、10、20、40mg/L組，采用電鏡、繪制生長曲線、MTT法、流式細胞儀的方法觀察成骨細胞的增殖情況。(4)免疫組化、原位雜交的方法檢測染氟后成骨細胞中MCM3蛋白質(zhì)表達和m

4、RNA的分布。(5)采用Real Time RT-PCR的方法測定染氟后小鼠和人成骨細胞內(nèi)MCM3mRNA量的變化。 結(jié)果：(1)改良后細胞培養(yǎng)方法重復(fù)性好、成骨細胞細胞生長穩(wěn)定、純化效果好，完全適合建立氟中毒的體外模型。核磁共振波譜法觀察表明：隨著環(huán)境氟離子濃度的升高，進入成骨細胞的氟離子量增加；隨著培養(yǎng)時間的延長，成骨細胞內(nèi)氟離子量越多；氟離子短期內(nèi)即可進入成骨細胞胞核，且細胞核中氟離子較易達到飽和；處于不同濃度氟環(huán)境中，高

5、濃度組20、40mg/L兩組細胞核氟離子量增加程度明顯于低濃度組。(2)氟對成骨細胞增殖的影響：染氟10天后，形態(tài)學(xué)上反映5、10、20mg/L組表現(xiàn)出細胞增殖；染氟48小時后，10mg/L組成骨細胞數(shù)量增長最快；染氟72小時后，以5mg/L組S期成骨細胞最多，平均占42.7％；各實驗方法均表現(xiàn)出40mg/L組抑制成骨細胞的生長。(3)成骨細胞染氟后，各實驗組及對照組成骨細胞中MCM3蛋白質(zhì)均有陽性表達，染氟組表達強度明顯高于對照組，表

6、達范圍也明顯大于對照組。從表達的位置看，棕色陽性結(jié)果主要見于細胞核，且在核中可見局部呈深棕色強陽性表達，細胞質(zhì)中也有少量表達，但表達比較弱。陽性細胞計數(shù)結(jié)果顯示：各染氟組陽性表達細胞數(shù)與對照組比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)，且均高于對照組。其中以10mg/L組陽性細胞數(shù)最高，與其他實驗組比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。(4)MCM3的mRNA相對定量顯示：小鼠和人的各組成骨細胞中，包括對照組，均有MCM3mRNA存在，但染氟后影響了

7、細胞中MCM3的mRNA量，小鼠成骨細胞中以5mg/L組表達量最高，是對照組的2.54倍，人成骨細胞中以2.5mg/L組和5mg/L組最高，是對照組的1.21倍，但隨著染氟劑量的增加，MCM3的mRNA量反而減少。氟對人成骨細胞中MCM3mRNA的相對表達量整體低于小鼠成骨細胞中的表達水平。 結(jié)論：氟在較短時間內(nèi)就可以進入成骨細胞，并到達細胞核，成骨細胞細胞核可能是氟離子的主要作用部位。氟進入細胞核后，低劑量的氟有促進成骨細胞的

8、增殖作用，而高濃度氟則表現(xiàn)為相對抑制作用。氟作用于成骨細胞后可以影響MCM3的蛋白質(zhì)表達、mRNA的分布和量，表現(xiàn)為低劑量促進、高劑量相對抑制的雙向作用。提示低劑量氟能夠使成骨細胞功能活躍、細胞增殖明顯,可能是由于氟的作用下致使MCM3持續(xù)高表達，從而成骨細胞DNA復(fù)制連續(xù)導(dǎo)致其數(shù)量增加、功能活躍，同時也可以判斷，氟的劑量高低對MCM3表達的影響是不同的，只有低濃度氟進入細胞核后，長期不斷地促進MCM3表達，使DNA復(fù)制異?；钴S，從而促