水稻RAD21同源基因RIX4的分子特性研究.pdf

1、本論文前期工作中，通過mRNA差別顯示獲得了受白葉枯菌(Xanthomonas oryzae pv.oyzae)誘導(dǎo)表達(dá)的差異cDNA片段。國(guó)際互連網(wǎng)Blastn查詢表明該基因?yàn)樾禄?。本課題旨在對(duì)這一與白葉枯菌抗性相關(guān)的基因進(jìn)行進(jìn)一步研究。 應(yīng)用RT-PCR技術(shù)獲得了該基因完整ORF序列，該序列全長(zhǎng)2,187 bp，編碼一個(gè)728氨基酸的預(yù)測(cè)蛋白，分子量約為80.35 KD，等電點(diǎn)為4.65。經(jīng)序列拼接獲得該基因的約5.3kb

2、的基因組DNA序列，將該基因組DNA序列與cDNA序列進(jìn)行比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)RIX4基因含11個(gè)外顯子和10個(gè)內(nèi)含子，所有10個(gè)內(nèi)含子都符合保守的/GT-AG/特征。Blastp分析結(jié)果表明，RIX4蛋白在N末端含Pfam04825，在C末端含Pfam04824保守結(jié)構(gòu)域，這兩個(gè)保守結(jié)構(gòu)域在RAD21/REC8類蛋白中很保守，表明RIX4蛋白屬于RAD21/REC8類粘合蛋白。其蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)由21.98％a-螺旋，7.01％延伸和71.0

3、2％隨意卷曲三種結(jié)構(gòu)模塊組成。 在不育系和保持系水稻花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂期幼穗中得到了RIX4基因另一轉(zhuǎn)錄本RIX4-5片段。對(duì)RIX4基因的5個(gè)轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行了序列和剪接模式的分析，結(jié)果表明第6和第7外顯子序列的選擇性剪接模式屬于常見的選擇外顯子上不同的5’或3’剪接位點(diǎn)進(jìn)行選擇性剪接的模式，而第6和9外顯子上序列的選擇性剪接模式不符合常見的7種剪接模式，是一種新的剪接模式。稻瘟病菌的侵染有利于RIX4基因前體mRNA剪接形成RIX

4、4-1轉(zhuǎn)錄本，白葉枯病菌的侵染有利于RIX4基因前體mRNA剪接形成RIX4-4轉(zhuǎn)錄本。 運(yùn)用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)出RIX4多肽，并通過免疫新西蘭大白兔制備了多克隆抗體，以此抗體檢測(cè)了植物體內(nèi)RIX4蛋白的含量。在受病原菌CR3誘導(dǎo)的水稻IR26愈傷組織中，在誘導(dǎo)0～60 min的水稻愈傷組織中均能檢測(cè)到RIX4基因編碼的全長(zhǎng)蛋白，而且隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，檢測(cè)到的蛋白量增多。在處于花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂旺盛期的不育系和保持系的幼

5、穗中，保持系中RIX4蛋白含量均高于不育系。在受白葉枯菌CR3侵染不同時(shí)期的IR26愈傷組織和不育系及保持系幼穗中僅能檢測(cè)到RIX4基因的全長(zhǎng)蛋白，而檢測(cè)不到其它轉(zhuǎn)錄本所編碼的蛋白。在受稻瘟菌生理小種ZB15(2001-046)誘導(dǎo)的近等基因系H7R和H7S的葉片及生理小種01-14誘導(dǎo)的嘉興02-03和中早27的葉片中，RIX4蛋白含量會(huì)隨著誘導(dǎo)時(shí)間的變化而變化，在不同的水稻品系中變化趨勢(shì)不同，但在受稻瘟菌誘導(dǎo)的水稻葉片中均能檢測(cè)到全

6、長(zhǎng)蛋白和RIX4-4轉(zhuǎn)錄本所編碼的蛋白，在蛋白水平上證明了RIX4基因存在不同的轉(zhuǎn)錄本。 構(gòu)建了RIX4基因RNA干涉表達(dá)載體，通過基因槍法對(duì)水稻粳稻品種中花¨進(jìn)行轉(zhuǎn)化，獲得9株轉(zhuǎn)pCAMBIA-HANNIBAL-RIX4(461)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)基因植株和12株轉(zhuǎn)pCAMBIA-HANNIBAL-RIX4(397)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)基因植株。對(duì)轉(zhuǎn)正義RIX4基因的轉(zhuǎn)基因水稻與轉(zhuǎn)反義RIX4基因的轉(zhuǎn)基因水稻進(jìn)行的抗病性測(cè)定表明，轉(zhuǎn)正義RIX4基因

7、的轉(zhuǎn)基因水稻可以增強(qiáng)對(duì)白葉枯菌的抗性，而轉(zhuǎn)反義RIX4基因的轉(zhuǎn)基因水稻降低了對(duì)白葉枯菌的抗性，表明RIX4基因是一個(gè)抗白葉枯病菌相關(guān)基因。 采用含3328個(gè)基因的cDNA陣列，分析了水稻光溫敏核不育系培矮64S于長(zhǎng)日照/高溫及短日照/低溫下幼穗的基因表達(dá)譜特征。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，以短日照/低溫(花粉可育)為參比，長(zhǎng)日照/高溫(花粉不育)下表達(dá)豐度顯著變化的基因高達(dá)14.60％，但RIX4基因的表達(dá)豐度變化不明顯。相對(duì)于482個(gè)基因下

8、調(diào)表達(dá)，僅4個(gè)基因上調(diào)表達(dá)，以實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)所有上調(diào)表達(dá)基因和隨機(jī)選擇的9個(gè)下調(diào)表達(dá)基因進(jìn)行了檢測(cè)，各基因表達(dá)豐度的變化趨勢(shì)一致，驗(yàn)證了cDNA陣列雜交結(jié)果的可靠性。這些差異表達(dá)基因幾乎涉及所有的細(xì)胞生物學(xué)反應(yīng)，同為MAPK同系物的MMK1和MMK2在mRNA水平表現(xiàn)出截然不同的基因表達(dá)特征，大量參與信號(hào)傳導(dǎo)的信號(hào)分子的表達(dá)豐度也發(fā)生明顯變化。針對(duì)這一結(jié)果，本文提出一種可能的解釋，即花粉形態(tài)建成及相應(yīng)的生理功能所需要的程序性轉(zhuǎn)