水稻W(wǎng)AX2同源基因的克隆及遺傳轉(zhuǎn)化的研究.pdf

1、干旱是造成農(nóng)作物大量減產(chǎn)的主要原因之一，角質(zhì)層是覆蓋在植物地上部分最表層的保護(hù)層，由上表皮蠟質(zhì)層和角質(zhì)層膜組成，具有降低植物表面的水分散失、防止紫外線輻射傷害和抵抗病蟲害侵入等其它環(huán)境脅迫等功能。擬南芥WAX2基因是首次發(fā)現(xiàn)的同時(shí)影響上表皮蠟質(zhì)層和角質(zhì)膜層代謝并顯著影響葉片水分蒸發(fā)的基因。其T-DNA插入缺失突變體的葉面水分蒸發(fā)顯著高于野生型，表明WAX2基因與植物抗蒸騰能力有關(guān)。對(duì)水稻W(wǎng)AX2同源基因的功能及表達(dá)調(diào)控的研究以及WAX2

2、同源基因過(guò)表達(dá)有助于闡明WAX2蛋白在植物抗蒸騰和抵抗病菌侵入方面的作用和應(yīng)用前景。 利用擬南芥的WAX2基因和WAX2蛋白，BLAST檢索出三個(gè)水稻同源基因，分別命名為OsWAX2-1、OsWAX2-2、OsWAX2-3，與擬南芥WAX2基因的同源性分別為56.0％、55.2％、52.0％；其預(yù)測(cè)的編碼蛋白與WAX2蛋白的同源性分別為61.5％、60.5％、64.7％。這三個(gè)蛋白都存在四個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)和兩個(gè)固醇去飽和酶的保守區(qū)，說(shuō)

3、明這三個(gè)蛋白質(zhì)都屬于跨膜蛋白并可能與角質(zhì)層的蠟質(zhì)合成有關(guān)。 從全長(zhǎng)cDNA數(shù)據(jù)庫(kù)檢索獲得了三個(gè)水稻W(wǎng)AX2同源基因的全長(zhǎng)cDNA，從含目的基因cDNA的質(zhì)粒中擴(kuò)增出三個(gè)水稻W(wǎng)AX2同源基因，在引物5'端添加了BamHⅠ或XbaⅠ兩個(gè)酶切位點(diǎn)，PCR產(chǎn)物經(jīng)此兩個(gè)限制性內(nèi)切酶酶切，并將其插入到用同樣限制性內(nèi)切酶酶切的pCAMBIA-1300M載體上，構(gòu)建了三個(gè)水稻W(wǎng)AX2同源基因的過(guò)表達(dá)載體pOEOSW2-1、pOEOSW2-2、p

4、OEOSW2-3，利用CaMV35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)水稻W(wǎng)AX2同源基因過(guò)表達(dá)。同樣從含目的基因cDNA的質(zhì)粒中擴(kuò)增出RNAi的順式和反式片斷，從質(zhì)粒pBI121中擴(kuò)增出部分GUS片斷用作RNAi的順?lè)雌瑪嘀g的中間序列，然后依次連接到中間載體pBSK上，最后將整個(gè)RNAi片斷雙酶切下來(lái)插入到表達(dá)載體pCAMBIA-1300M中，構(gòu)建了三個(gè)水稻W(wǎng)AX2同源基因的RNAi表達(dá)載體pCROSW2-1、pCROSW2-2、pCROSW2-3，同樣也