骨骼肌缺血再灌注致心肌損傷蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、研究目的
　　差異蛋白質(zhì)組學(xué)為我們提供了全面、系統(tǒng)了解創(chuàng)傷應(yīng)激心肌損傷表達(dá)差異的工具。為深入探討骨骼肌缺血再灌注創(chuàng)傷致心肌損傷的生物學(xué)機(jī)制，本研究采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，較全面、高通量地篩選鑒定骨骼肌缺血再灌注心肌損傷的相關(guān)蛋白質(zhì)，旨在發(fā)現(xiàn)缺血再灌注心肌損傷中尚未研究報(bào)道的蛋白及其在心肌損傷過程中的作用。
　　研究方法
　　1、建立大鼠骨骼肌缺血再灌注心肌損傷模型：雄性Wistar大鼠20只，分為2組：假手術(shù)組（sham)

2、10只，缺血再灌注(IR)組（缺血4小時(shí)、再灌注4小時(shí))10只。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，下腔靜脈取血，觀察指標(biāo)：血清CK,CYCS；肌鈣蛋白T；心肌HE染色；心臟超聲對(duì)模型動(dòng)物的心臟功能進(jìn)行評(píng)價(jià)。
　　2、大鼠心肌蛋白雙向凝膠電泳及結(jié)果分析：再灌注結(jié)束后，取左心室部分放入液氮冷凍。心肌組織全蛋白提取后行雙向凝膠電泳(2-DE)，經(jīng)凝膠染色、掃描后獲得2-DE圖譜，運(yùn)用ImageMaster2DPlatinum5.0凝膠圖像分析軟件對(duì)2-DE凝

3、膠圖像進(jìn)行差異表達(dá)分析,差異明顯蛋白點(diǎn)經(jīng)膠內(nèi)酶切后以納升超高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜NanoUPLC-ESI-MS/MS進(jìn)行分析，通過Mascot數(shù)據(jù)庫檢索鑒定差異蛋白質(zhì)。
　　3、在大鼠骨骼肌缺血再灌注心肌損傷模型上，采用Westernblot及免疫組化驗(yàn)證候選差異蛋白的表達(dá)。
　　研究結(jié)果
　　1、大鼠骨骼肌缺血4小時(shí)再灌注4小時(shí)后造成心肌損傷（肌鈣蛋白升高，HE染色大體結(jié)構(gòu)改變），心臟收縮功能下降。
　　

4、2、以假手術(shù)組及模型組心肌蛋白行雙向電泳，得到聚焦良好、顯色清晰、相似性高的2-DE圖譜，以Imagemaster軟件對(duì)各組圖譜分析后得到15個(gè)差異表達(dá)蛋白點(diǎn)，差異點(diǎn)分布在pI5.0-8.0、分子量14.0kDa-66.0kDa之間。其中9個(gè)蛋白點(diǎn)上調(diào)，6個(gè)蛋白點(diǎn)表達(dá)下調(diào)，將各點(diǎn)行膠內(nèi)酶解、質(zhì)譜分析后獲得差異表達(dá)蛋白譜。
　　3、通過分析差異表達(dá)蛋白譜，發(fā)現(xiàn)其功能涉及到細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白：myozenin，心臟型肌球蛋白結(jié)合蛋白；能

5、量代謝相關(guān)蛋白：NADH脫氫酶（泛醌）1α亞復(fù)合體亞單位10，磷酸丙糖異構(gòu)酶，腺苷酸激酶同工酶1，蘋果酸脫氫酶，琥珀酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶，細(xì)胞色素C氧化酶亞單位VIa；應(yīng)激相關(guān)蛋白：αB-晶狀體蛋白，輔酶Q7，熱休克蛋白B7；其他蛋白：細(xì)胞因子誘導(dǎo)凋亡抑制因-1（CIAPIN1），功能定位未知的推測蛋白。
　　4、我們用Westernblot及免疫組化方法回復(fù)驗(yàn)證了不同類別的三種蛋白（CIAPIN1、myozenin和TIM）在兩組動(dòng)物

6、心肌組織中的表達(dá)變化，證實(shí)了2-DE結(jié)果的可靠性，為下一步功能驗(yàn)證提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　結(jié)論
　　1、成功復(fù)制骨骼肌缺血再灌注心肌損傷動(dòng)物模型。該模型操作簡便可靠，重復(fù)性好，可以模擬與臨床相近的損傷，為下一步研究提供了可靠的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?br>　　2、成功獲得分辨率高、重復(fù)性好的假手術(shù)組及骨骼肌缺血再灌注心肌蛋白電泳圖譜。比較分析差異組間發(fā)現(xiàn)15個(gè)差異點(diǎn)，鑒定得到的差異蛋白質(zhì)涵蓋了細(xì)胞骨架相關(guān)、能量代謝相關(guān)、應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)及