激肽釋放酶蛋白質(zhì)治療腦缺血再灌注損傷及可能的機(jī)制.pdf

1、缺血性腦卒中是引起人類非自然死亡和致殘的主要疾病之一。激肽釋放酶一激肽系統(tǒng)(Kallikrein-kinin system，KKS)作為公認(rèn)的炎癥調(diào)節(jié)系統(tǒng)在缺血性腦血管病不同時期的病理過程中發(fā)揮多種重要作用。KKS系統(tǒng)中主要成分之一激肽釋放酶又可分為組織型和血漿型兩類。近年來在腦缺血實(shí)驗(yàn)研究及臨床應(yīng)用中均發(fā)現(xiàn)，其中的組織型Kallikrein(文中的Kallikrein均指組織型)對缺血狀況下腦組織有明確的保護(hù)作用。然而，由于大分子物質(zhì)

2、難以逾越血腦屏障及生物膜，這就限制了許多大分子藥物對神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療。近年建立的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)(Protein transduction)或稱為蛋白質(zhì)治療(Protein therapy)的技術(shù)不僅能使生物大分子高效地跨過血腦屏障和穿越生物膜進(jìn)入細(xì)胞，而且能使進(jìn)入胞內(nèi)的生物大分子物質(zhì)保持其原有的生物活性。 本研究首先構(gòu)建了蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)域．激肽釋放酶(Protein transductiondomain-kallikrein，PTD-

3、kaUikrein)復(fù)合物，并對其穿透功能和生物毒性進(jìn)行驗(yàn)證。為排除復(fù)雜體內(nèi)環(huán)境的影響，在第二部分工作中，應(yīng)用PTD-kallikrein及緩激肽受體B2的特異性抑制劑對缺糖、缺氧(Oxygen-glucose depriration，OGD)再復(fù)糖、復(fù)氧的體外培養(yǎng)神經(jīng)元模型進(jìn)行了干預(yù)，觀察了PTD-kallikrein對該條件下培養(yǎng)的神經(jīng)元保護(hù)作用，并探討了其可能的作用機(jī)制。在第三部分工作中，我們又對局灶性腦缺血大鼠進(jìn)行了干預(yù)，以進(jìn)一

4、步驗(yàn)證PTD-kaUikrein對腦缺血大鼠的腦保護(hù)作用和可能的機(jī)制。本研究擬通過了解PTD-kallikrein對腦缺血再灌注損傷的蛋白質(zhì)治療及作用機(jī)制，為腦缺血的治療提供新的途徑和方法。 第一部分PTD-kallikrein的合成及其對生物膜、血腦屏障通透功能的鑒定 人工合成PTD肽段(氨基酸序列：RRRRRRRRRGC)，用化學(xué)交聯(lián)法構(gòu)建PTD-kallikrein。將熒光標(biāo)記的 PTD-kallikrein及Ka

5、llikrein分別孵育不同細(xì)胞，在熒光顯微鏡下觀察兩種熒光物質(zhì)對生物膜的通透能力。正常大鼠尾靜脈注射PTD-kallikrein及Kallikrein，2.5h后斷頭取腦組織勻漿，Western-blot測定腦內(nèi)Kallikrein含量的變化，以觀察其對血腦屏障的通透能力。另用不同濃度的PTD肽段分別孵育不同細(xì)胞，MTT法檢測細(xì)胞生存率，觀察PTD肽段對細(xì)胞是否有毒性作用。結(jié)果顯示：1．PTD-kallikrein可以通過生物膜及跨越

6、血腦屏障；2．PTD肽段本身對細(xì)胞無明顯的毒性作用。 第二部分 PTD-kallikrein對缺糖、缺氧后再恢復(fù)的神經(jīng)元的保護(hù)作用 原代培養(yǎng)大鼠皮層神經(jīng)元，然后給予OGD1.5h后復(fù)糖、復(fù)氧。除對照組外，其余各干預(yù)阻在OGD前24h分別給予100nmol/l的B2受體抑制劑HOE140和/或10、50及100 nmol/l的PTD-kallikrein、Kallikrein，復(fù)糖、復(fù)氧后4h采用MTT法測定細(xì)胞生存率，T

7、UNEL測定細(xì)胞凋亡。結(jié)果顯示：1．PTD-kallikrein可顯著提高缺糖、缺氧再復(fù)糖、復(fù)氧條件下培養(yǎng)的神經(jīng)元生存率并減少其凋亡；2．B2受體抑制劑能明顯抑制PTD-kallikrein對神經(jīng)元的保護(hù)。 第三部分PTD-kallikrein對大鼠MCAO模型缺血再灌注損傷的保護(hù)作用 制作大鼠左側(cè)大腦中動脈梗塞模型，缺血90min后恢復(fù)再灌流。除假手術(shù)組外，其余各干預(yù)阻分別在缺血再灌流后即刻尾靜脈給予2ml/kg的生理

8、鹽水、0.75nmol/kg的B2受體抑制劑bradyzide和/或3.15×10<'-2>nmol/kg的PTD-kallikrein、Kallikrein2生行干預(yù)。再灌流24h后處死動物，NSS量表測定神經(jīng)功能評分,TTC染色測定梗死體積，ELISA測定細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α及PGE<,2>的分泌。結(jié)果顯示：1．PTD-kallikrein能顯著改善腦缺血導(dǎo)致的神經(jīng)功能障礙、減小梗死體積、抑制細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α

9、及PGE<,2>的的釋放；2．B2受體抑制劑能明顯抑制PTD-kallikrein的神經(jīng)保護(hù)作用。 結(jié)論 1．PTD-kallikrein可以高效地通過生物膜及跨越血腦屏障且對細(xì)胞無明顯毒性作用； 2．PTD-kallikrein對缺糖、缺氧再復(fù)糖、復(fù)氧條件下培養(yǎng)的神經(jīng)元及大鼠MCAO模型缺血再灌注損傷均有一定的保護(hù)作用； 3．PTD-kallikrein的保護(hù)作用可能是通過B2受體的介導(dǎo)而發(fā)揮其功效的。