重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2明膠納米微球的制備及其對(duì)SD大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)行為的影響.pdf

1、背景:
　　骨缺損和骨不愈合是臨床常見(jiàn)病，如何修復(fù)骨缺損和促進(jìn)骨愈合也是骨組織工程研究的重要內(nèi)容。支架、細(xì)胞和因子是骨組織工程研究的三大要素。近年來(lái)，有關(guān)骨生長(zhǎng)因子的研究日益增多，BMP-2（Bone Morphogenetic Protein-2，骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2）是最重要的骨生長(zhǎng)因子之一，其促進(jìn)骨修復(fù)的功能已得到相關(guān)研究證實(shí)。BMP-2在體內(nèi)含量很少，基因重組表達(dá)技術(shù)則實(shí)現(xiàn)了rhBMP-2（Recombinant Human

2、 Bone Morphogenetic Protein-2，重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2）的批量生產(chǎn)，使其臨床應(yīng)用成為可能，但rhBMP-2的應(yīng)用存在體內(nèi)半衰期短、降解快的問(wèn)題，如果增加其使用量將又會(huì)帶來(lái)一系列的并發(fā)癥，使其臨床應(yīng)用嚴(yán)重受限。微球緩釋技術(shù)是解決這個(gè)問(wèn)題的方法之一，rhBMP-2與微球復(fù)合，不但能保護(hù)因子，還能延長(zhǎng)其在體內(nèi)的作用時(shí)間，減少并發(fā)癥和治療費(fèi)用。所以，本研究的目的是為rhBMP-2制備一種納米載體，使其更廣泛地應(yīng)用于

3、骨科疾病的治療。
　　目的:
　　1.制備重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2-明膠納米微球（Recombinant Human Bone Morphogenetic Protein-2-Gelatin nanoparticle，rhBMP-2-GN)，檢測(cè)其理化特性和釋藥特點(diǎn)。
　　2.檢測(cè)rhBMP-2-GN對(duì)BMSCs（Bone marrow mesenchymal stem cells）的增值和分化效應(yīng)。
　　3.為

4、rhBMP-2的臨床應(yīng)用提供合適的納米載體，為下一步動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提供必要的依據(jù)和更加可靠的解決方案。
　　方法：
　　1. rhBMP-2-GN的制備及檢測(cè)：（1）制備空白明膠納米微球。（2）掃描電鏡（Scanning Electron Microscope，SEM）觀察明膠納米微球的表面形態(tài)，計(jì)算其平均粒徑，透射電鏡（Transmission Electron Microscope，TEM）觀察明膠納米微球的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，粒度分析

5、儀檢測(cè)其吸水后的平均粒徑，計(jì)算其溶脹率。（3）將rhBMP-2和GN進(jìn)行復(fù)合制備rhBMP-2-GN，利用酶聯(lián)免疫吸附法（Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay，ELISA）測(cè)定加載的rhBMP-2量，計(jì)算其包封率和載藥量。（4）將rhBMP-2-GN分散到磷酸鹽緩沖液（PBS）中，檢測(cè)其累計(jì)釋藥的百分率。
　　2. rhBMP-2-GN對(duì)BMSCs的生物效應(yīng)：(1)利用CCK-8法檢測(cè)rhBMP-2-

6、GN對(duì)BMSCs早期增殖效應(yīng)的影響。(2)利用ALP染色法檢測(cè)rhBMP-2-GN對(duì)BMSCs早期分化效應(yīng)的影響。(3)利用茜素紅-S鈣結(jié)節(jié)染色法檢測(cè)rhBMP-2-GN對(duì)BMSCs晚期分化效應(yīng)的影響。
　　結(jié)果：
　　1.rhBMP-2-GN的制備：（1）“二次凝聚法”成功制備空白明膠納米微球。（2）明膠納米微球的物理特性：明膠納米微球表面光滑，球形規(guī)整，內(nèi)部多孔隙、通道，分散均一，干粉狀態(tài)平均粒徑為171.49 nm，吸

7、水膨脹后平均粒徑為313.01 nm，溶脹率為1.83。（3）成功制備rhBMP-2-GN，其包封率和載藥量分別是98.13±0.131％和58.89±0.079 ng/mg。（4）rhBMP-2-GN的體外釋藥時(shí)間在一個(gè)月以上。
　　2. rhBMP-2-GN對(duì)BMSCs的生物學(xué)作用：（1）rhBMP-2-GN組在第4天和第7天的細(xì)胞增值作用均明顯優(yōu)于對(duì)照組和明膠納米微球組（P<0.05）。（2）rhBMP-2-GN孔在第4天和

8、第7天的ALP染色均比對(duì)照孔和明膠納米微球孔的染色要深，差異較明顯。（3）rhBMP-2-GN孔在第28天出現(xiàn)鈣結(jié)節(jié)的數(shù)目能明顯多于對(duì)照孔和明膠納米微球孔。
　　結(jié)論：
　　1.“二次凝聚法”成功制備空白明膠納米微球，使rhBMP-2-GN具有較高的包封率和載藥量，體外緩釋效果良好。2. rhBMP-2-GN通過(guò)明膠納米微球的降解逐步釋放rhBMP-2，延長(zhǎng)了rhBMP-2的作用時(shí)間，明顯促進(jìn)了BMSCs的早期增殖和向成骨細(xì)