人胃癌側(cè)群細(xì)胞分選與生物學(xué)特性鑒定.pdf

1、第一部分人胃癌側(cè)群細(xì)胞檢測(cè)分選與干細(xì)胞基因表型分析
　　[目的]檢測(cè)和分選胃癌細(xì)胞株中的SP細(xì)胞，并分析其干細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)情況。
　　[方法]選擇4株不同分化程度的人胃癌細(xì)胞系MKN-28、SGC-7901、BGC-823和AGS，以Hoechst33342/碘化丙啶熒光染料雙染，維拉帕米拮抗對(duì)照，應(yīng)用流式細(xì)胞儀熒光激活分選法檢測(cè)SP細(xì)胞比例并進(jìn)行分選；RT-PCR比較分選所得的SP細(xì)胞和nonSP細(xì)胞中藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ABC

2、G2、干細(xì)胞膜蛋白表型CD133、CD24、CD44和干細(xì)胞信號(hào)通路相關(guān)調(diào)控基因OCT-4、NOTCH、NANOG、BMI-1的表達(dá)差異。
　　[結(jié)果]胃癌細(xì)胞MKN-28、SGC7901和BGC-823中SP細(xì)胞比例分別為0.46％-2.7％、1.89％-2.33％和1.00％-3.55％；胃癌細(xì)胞AGS中未能檢測(cè)出SP細(xì)胞。半定量PCR結(jié)果顯示，SP細(xì)胞中ABCG2的表達(dá)量明顯高于nonSP細(xì)胞；實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果進(jìn)一步顯

3、示，側(cè)群細(xì)胞中ABCG2約為非側(cè)群細(xì)胞中的8倍。干細(xì)胞膜蛋白表型CD24和CD44在胃癌SP細(xì)胞中的表達(dá)強(qiáng)于nonSP細(xì)胞；干細(xì)胞信號(hào)通路相關(guān)調(diào)控基因OCT-4、NOTCH、NANOG在SP細(xì)胞中的表達(dá)強(qiáng)于nonSP細(xì)胞；CD133、BMI-1基因在SP和nonSP細(xì)胞中的表達(dá)無差異。
　　[結(jié)論]側(cè)群細(xì)胞可在胃癌細(xì)胞中被檢測(cè)和分選，但并非所有的胃癌細(xì)胞株中均含有側(cè)群細(xì)胞。胃癌側(cè)群細(xì)胞高度表達(dá)藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ABCG2、干細(xì)胞膜蛋白表

4、型CD44、CD24和干細(xì)胞調(diào)控基因OCT-4、NANOG、NOTCH。
　　第二部分人胃癌側(cè)群細(xì)胞生物學(xué)特性鑒定
　　[目的]系統(tǒng)分析胃癌SP細(xì)胞體內(nèi)外增殖活力、成瘤能力、侵襲力等基本生物學(xué)特性。
　　[方法]通過細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(CCK-8法)、平板克隆形成試驗(yàn)比較胃癌SP與nonSP細(xì)胞體外增殖活力；應(yīng)用細(xì)胞侵襲transwell試驗(yàn)比較胃癌SP與nonSP細(xì)胞侵襲力差異；應(yīng)用異種移植Nod/SCID小鼠成瘤實(shí)驗(yàn)比較

5、胃癌SP與nonSP細(xì)胞體內(nèi)致瘤能力差異；通過胃癌SP細(xì)胞體外培養(yǎng)比例回歸和體內(nèi)成瘤細(xì)胞分化現(xiàn)象觀察鑒定其不對(duì)稱分裂和多向分化特性。
　　[結(jié)果]細(xì)胞生長(zhǎng)曲線實(shí)驗(yàn)顯示，僅胃癌MKN-28細(xì)胞株SP細(xì)胞增殖活力明顯強(qiáng)于nonSP細(xì)胞，而BGC-823和SGC-7901細(xì)胞株來源的SP與nonSP細(xì)胞總體生長(zhǎng)曲線差別未能無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。平板克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，胃癌細(xì)胞株MKN-28、BGC-823和SGC-7901中SP細(xì)

6、胞克隆形成率均高于nonSP細(xì)胞，其中MKN-28 SP細(xì)胞克隆形成能力明顯高于nonSP細(xì)胞(P<0.05)。胃癌nonSP細(xì)胞侵襲力明顯強(qiáng)于SP細(xì)胞(P<0.05)。異種移植瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Nod/SCID小鼠體內(nèi)胃癌SP與nonSP細(xì)胞成瘤能力相仿(P>0.05)。胃癌SP細(xì)胞體外培養(yǎng)后，其中SP比例由起始的100％下降至1.0％，nonSP細(xì)胞中SP比例由起始的0％增加到0.3％；胃癌SP與nonSP細(xì)胞在體內(nèi)成瘤后，均可轉(zhuǎn)化成

7、不同分化程度的胃癌細(xì)胞。
　　[結(jié)論]胃癌SP細(xì)胞體外增殖活力、體內(nèi)成瘤和分化能力nonSP細(xì)胞相仿，SP細(xì)胞富集胃癌干細(xì)胞的依據(jù)不足。胃癌SP細(xì)胞侵襲能力較弱，胃癌細(xì)胞侵襲力可能主要與nonSP細(xì)胞有關(guān)。
　　第三部分人胃癌側(cè)群細(xì)胞化療藥物耐受性的相關(guān)分析
　　[目的]研究胃癌SP與nonSP細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐受性差異，并對(duì)其表達(dá)腫瘤耐藥相關(guān)基因情況進(jìn)行分析。
　　[方法]通過CCK-8法檢測(cè)比較胃癌SP與no

8、nSP細(xì)胞對(duì)于化療藥物5-FU和DDP的耐受性差異；應(yīng)用腫瘤化療耐藥相關(guān)的功能基因芯片，對(duì)胃癌SP與nonSP細(xì)胞中表達(dá)腫瘤耐藥相關(guān)基因情況進(jìn)行比較分析
　　[結(jié)果]化療藥物5-Fu對(duì)胃癌細(xì)胞株SGC7901來源的SP的半效抑制濃度IC50為0.3346mg/ml，明顯高于nonSP細(xì)胞的0.0142mg/ml(P<0.05)；化療藥物DDP對(duì)胃癌SP的半效抑制濃度IC50為0.0055 mg/ml，亦明顯高于nonSP細(xì)胞的0.

9、0032mg/ml(P<0.05)。結(jié)果顯示胃癌SP細(xì)胞對(duì)化療藥物5-FU和DDP的耐受性明顯強(qiáng)于nonSP細(xì)胞。功能基因芯片結(jié)果顯示，在84個(gè)常見的腫瘤化療耐藥相關(guān)基因中，1個(gè)基因在胃癌SP細(xì)胞中表達(dá)低于nonSP細(xì)胞；15個(gè)基因在胃癌SP細(xì)胞中表達(dá)高于nonSP細(xì)胞，其中ABCB1、ABCG2、BAX、MYC、GSTP1、AR等6個(gè)基因的表達(dá)差異顯著(P<0.05)。
　　[結(jié)論]胃癌SP細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐受性明顯強(qiáng)于胃癌no