人胰腺癌腫瘤干細胞樣SP細胞的分離鑒定及生物學(xué)特性研究.pdf

1、胰腺癌是消化系統(tǒng)中預(yù)后最差的腫瘤之一，即使接受根治性切除術(shù)后的患者其5年生存率也只有5～10%。因而深入闡明胰腺癌發(fā)生機制，尋找胰腺癌治療的新靶點對于改善預(yù)后具有重要意義。最新研究認為腫瘤是一種干細胞疾病，是由少數(shù)具有成瘤能力的腫瘤干細胞增殖發(fā)育而成的異常組織。近年來國內(nèi)外學(xué)者通過特異性的細胞表面標志已在急性髓細胞樣白血病、乳腺癌、腦腫瘤、前列腺癌、肺癌和結(jié)腸癌等腫瘤中成功分離出相應(yīng)的腫瘤干細胞，并證明它們在腫瘤的形成和生長過程中的決定

2、性作用。亦有學(xué)者從事胰腺癌干細胞的分離鑒定，但迄今尚未確定出公認的表面標志物。
　　 Li等通過鑒定提出CD44+CD24+ESA+的細胞亞群是胰腺癌干細胞，Hermann等認為胰腺癌干細胞的表型是CD133+。另外，他們的研究主要是證明胰腺癌是由腫瘤干細胞形成的，調(diào)控其生長增殖的信號通路尚未報道。腫瘤SP細胞的分離鑒別是被一致公認的研究腫瘤干細胞生物學(xué)特性的替代方法。本研究采用流式分析證實了胰腺癌中SP細胞的存在，通過體內(nèi)體外

3、實驗研究其包括干細胞特性在內(nèi)的生物學(xué)特性，并初步探討了PI3K/mTOR信號通路對其生存增殖的調(diào)控作用。
　　 第一部分：胰腺癌SP細胞的分離和表型分析
　　 目的：分離胰腺癌中的SP細胞亞群并確定其表型。
　　 方法：應(yīng)用Hoechst 33342染色，流式細胞儀檢測6個胰腺癌細胞系及3個原代培養(yǎng)的臨床胰腺癌標本中SP細胞的含量。選取典型的具SP細胞的細胞系檢測SP細胞的表型。
　　 結(jié)果：除了BXPC

4、-3，其他胰腺癌細胞系及原代培養(yǎng)標本都存在Verapamil敏感的SP細胞。PANC-1、CAPAN-1、ASPC-1、PC-3和SW-1990中SP細胞的比例分別為7.84%,11.22%，16.88%，0.43%和2.25%。3個臨床標本中SP細胞的比例分別為0.33%,2.79%和0.98%。PANC-1、CAPAN-1和ASPC-1中的絕大多數(shù)SP細胞的表型為CD133+和CD44+CD24-ESA+.
　　 結(jié)論：胰腺

5、癌中的確存在SP細胞，其表型為CD133+和 CD44+CD24-ESA+。
　　 第二部分：胰腺癌干細胞樣SP細胞生物學(xué)特性及化療耐藥機制初探
　　 目的：分離鑒定胰腺癌干細胞樣的SP細胞亞群并探討其生物學(xué)特性及化療耐藥機制。
　　 方法：應(yīng)用Hoechst 33342 染色，F(xiàn)ACS 分選胰腺癌細胞系PANC-1中的SP細胞。通過平板克隆形成試驗和NOD-SCID小鼠異種移植成瘤試驗比較SP細胞與non-SP

6、細胞的克隆形成能力及成瘤能力，通過對體外培養(yǎng)的SP細胞和SP細胞衍生腫瘤的Hoechst 33342復(fù)染SP再分析判斷其是否具有分化潛能。通過成球?qū)嶒炘u價SP細胞的自我更新能力。采用Transwell試驗和MTT試驗比較分選的SP細胞與non-SP細胞的侵襲能力及其對化療藥物的耐藥性。應(yīng)用實時定量PCR檢測SP細胞與non-SP細胞中ABCB1和ABCG2的表達。采用流式細胞術(shù)比較SP細胞與non-SP細胞的細胞周期。
　　 結(jié)

7、果：PANC-1 SP細胞具有較高的自我更新能力和成瘤能力并且能夠發(fā)生不對稱分裂生成non-SP細胞。SP細胞的侵襲力及其對化療藥物的耐藥性明顯高于non-SP細胞。SP細胞中ABCB1和ABCG2的表達水平明顯高于non-SP細胞且大多數(shù)細胞處于G1期。
　　 結(jié)論：胰腺癌SP細胞富集了具有高侵襲能力的干細胞樣腫瘤起始細胞，其耐藥機制可能與其大多數(shù)細胞處于靜息期及某些ABC轉(zhuǎn)運體的高表達相關(guān)。
　　 第三部分：PI3K

8、//mTOR信號通路參與胰腺腫瘤干細胞樣SP細胞生存增殖的調(diào)控
　　 目的：分離鑒定胰腺癌中腫瘤干細胞樣的SP細胞亞群并探討PI3K/mTOR信號通路對其生存與增殖的調(diào)控。
　　 方法：應(yīng)用流式分析檢測胰腺癌細胞系PANC-1中SP細胞的含量。觀察加入PI3K/mTOR信號通路特異性抑制劑LY294002或雷帕霉素培養(yǎng)后PANC-1中SP細胞的含量變化。采用MTT試驗和克隆形成試驗檢測LY294002或雷帕霉素對分選的S

9、P細胞和non-SP細胞的抑制作用。
　　 結(jié)果：加入LY294002 或雷帕霉素培養(yǎng)后PANC-1 SP細胞的含量明顯降低（LY294002，7.60±0.27% vs 1.90±0.22%，P=0.000；雷帕霉素，7.60±0.27% vs 1.14±0.20%，P=0.000）。LY294002對SP細胞和non-SP細胞的生存抑制率（1-細胞存活率）分別是47.87±3.82%和27.64±2.09%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義

10、（P=0.001）。雷帕霉素對SP細胞的生存抑制率亦高于non-SP細胞（57.04±2.78% vs 35.99±3.11%，P=0.001）。LY294002和雷帕霉素對SP細胞的克隆形成能力的抑制率也高于non-SP細胞（LY294002，54±6.56% vs 34.67±3.06%，P=0.01；雷帕霉素，48±3.61% vs 30.67±3.21%，P=0.003。
　　 結(jié)論：PI3K/mTOR信號通路參與對其生