膀胱移行細(xì)胞癌中β-catenin的表達(dá)及意義.pdf

1、上皮鈣粘素-連環(huán)素系統(tǒng)(E—cadherin-catenin，E—cad-cat)及Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的失調(diào)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、浸潤和轉(zhuǎn)移關(guān)系密切。β-catenin蛋白是承擔(dān)Wnt信號(hào)向細(xì)胞傳遞致使細(xì)胞增殖的中間分子，在腫瘤發(fā)生及發(fā)展上起重要作用；同時(shí)β-catenin作為細(xì)胞間粘附結(jié)構(gòu)E—cadherincatenin中的重要分子，它的變化對(duì)腫瘤細(xì)胞粘附能力下降，獲得轉(zhuǎn)移侵襲能力有關(guān)，因此β-catenin作為兩大系統(tǒng)的關(guān)鍵分子，成

2、為惡性腫瘤研究的熱點(diǎn)。 膀胱移行細(xì)胞癌是泌尿系統(tǒng)最常見的腫瘤，是泌尿外科臨床上的主要病種之一。該實(shí)驗(yàn)針對(duì)β—catenin在膀胱移行細(xì)胞癌中的表達(dá)特點(diǎn)進(jìn)行研究，了解和分析β-catenin在該腫瘤發(fā)生、進(jìn)展及預(yù)后之間的相關(guān)關(guān)系。實(shí)驗(yàn)分為以下三個(gè)部分：1.免疫組化法了解E-cad、β-catenin在膀胱移行細(xì)胞癌中的表達(dá)及定位情況，表達(dá)情況與預(yù)后的關(guān)系；2.Westernblot法，半定量了解β-catenin蛋白在正常膀胱移行

3、上皮細(xì)胞和不同分級(jí)分期的移行上皮癌之間表達(dá)情況；3.用RT-PCR法了解β—cateninmRNA在正常膀胱移行上皮細(xì)胞和移行上皮癌之間表達(dá)情況，確定β—catenin蛋白表達(dá)量與對(duì)應(yīng)mRNA之間的關(guān)系。 實(shí)驗(yàn)材料與方法: 一、實(shí)驗(yàn)材料 1.主要儀器：切片機(jī)、烤片機(jī)、高壓鍋、溫育箱、Olympus顯微鏡、顯微照相裝置、組織勻漿機(jī)。超聲粉碎機(jī)、電泳儀、轉(zhuǎn)印儀、搖床、高速低溫離心機(jī)、自動(dòng)電泳凝膠成像分析儀、低溫超速離

4、心機(jī)、分光光度計(jì)。 2.主要試劑：鼠抗人E-cadherin單克隆抗體、鼠抗人β-catenin單克隆抗體、S-P試劑盒。預(yù)染蛋白marker，堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗和BCIP/NBT顯色試劑盒，丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、TEMED、轉(zhuǎn)印用PVDF膜。TRIZOL、RT-PCR試劑盒、焦磷酸乙酯、瓊脂糖、溴化已錠等。 二、實(shí)驗(yàn)方法 1.選取1994～1997年間手術(shù)切除的膀胱移行細(xì)胞癌標(biāo)本65例，隨訪60個(gè)月

5、。所有標(biāo)本均為福爾馬林固定，石蠟包埋。取10例正常膀胱移行上皮標(biāo)本，福爾馬林固定，石蠟包埋，作為對(duì)照。石蠟標(biāo)本制成4μm切片。免疫組織化S-P法檢測(cè)β-catenin及E-cadherin蛋白表達(dá)。按試劑說明書的步聚進(jìn)行。β—catenin、E-cadherin在正常膀胱移行上皮細(xì)胞呈現(xiàn)胞膜棕色著色。以正常膀胱移行上皮表達(dá)的強(qiáng)度和方式作為對(duì)照，每例切片在光鏡下選取5個(gè)高倍視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞未見著色者定義為陰性，見棕色著

6、色者定義為陽性。如腫瘤組織染色方式和強(qiáng)度與正常膀胱粘膜相同，定義為E—cadheRN或β-catenin正常表達(dá)；如果切片中陽性細(xì)胞數(shù)占腫瘤細(xì)胞總數(shù)少于90％、或雖然陽性細(xì)胞數(shù)大于90％但著色強(qiáng)度明顯低于膀胱粘膜或分布不在細(xì)胞膜，定義為異常表達(dá)。比較β-catenin、E-cadherin在不同分級(jí)和分期間表達(dá)的差異情況，采用計(jì)數(shù)資料x2檢驗(yàn)。分別比較β—catenin和E-cadherin陽性組和陰性組的5年生存率，采用計(jì)數(shù)資料x2檢

7、驗(yàn)。 2.手術(shù)中切除的新鮮膀胱移行細(xì)胞癌及正常膀胱移行上皮標(biāo)本，迅速轉(zhuǎn)至液氮罐中保存?zhèn)溆?，同時(shí)保留福爾馬林固定、石蠟包埋標(biāo)本，共42例。免疫組織化學(xué)檢測(cè)β-catenin蛋白的過程同上。WesternBlot：組織細(xì)胞勻漿和蛋白提取、蛋白定量、電泳、轉(zhuǎn)印、雜交及顯色，實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)自動(dòng)電泳凝膠成像分析儀采集，進(jìn)行灰度值測(cè)定。對(duì)比正常組織和膀胱移行上皮癌之間表達(dá)的差異，比較正常膀胱上皮、腫瘤組織不同病理分級(jí)和臨床分期之間蛋白表達(dá)量的情

8、況，用OD值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用計(jì)量資料t檢驗(yàn)。 3.采用上面用于Westernblot檢測(cè)的新鮮標(biāo)本用于本實(shí)驗(yàn)的RT-PCR檢測(cè)，共選擇24例(包括相應(yīng)的癌旁正常移行上皮)。按試劑說明書提取RNA。β—catenin引物：上游5'TTCCAGACACGCTATCATGC3'，下游5'AATCCACTGGTGAACCAAGC3'；β-actin引物：上游5'ATCATGTTTGAGACCTTCAACA3'，下游5'CATCTCTT

9、GCTCGAAGTCCA3'，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA及PCR擴(kuò)增。48℃30min，94℃2min反轉(zhuǎn)錄后，直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增，循環(huán)條件為94℃30sec、55℃30sec、68℃lmin35個(gè)循環(huán)。以100bpDNAMarker作為分子量標(biāo)準(zhǔn)，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2％瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察。用電泳凝膠成像分析系統(tǒng)測(cè)定擴(kuò)增帶整合光密度值，以β-actin內(nèi)參照值標(biāo)準(zhǔn)化β-catenin值，得到相對(duì)含量。比較正常移行上皮與腫瘤之間及腫瘤各臨床分期

10、組間的β-cateninmRNA相對(duì)含量值，用X±S表示，樣本均數(shù)作t檢驗(yàn)，顯著性差異設(shè)為95％。 結(jié)果: 1.E-cad及β-cat在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級(jí)腫瘤中的正常表達(dá)率分別為63.2％、35.7％、22.2％和73.7％、57.1％、44.4％；在Tis-T1和T2～4腫瘤中的異常表達(dá)分別為60.7％、24.3％和82.1％、40.5％。E-cad表達(dá)在病理分級(jí)及臨床分期間比較，有顯著性差異；β-cat表達(dá)在病理分級(jí)間比較

11、無顯著性差異，臨床分期間比較，有顯著性差異。E-cad正常表達(dá)及異常表達(dá)組5年生存率分別為76.9％、43.6％，差異有顯著性；β-cat正常表達(dá)組和異常表達(dá)組5年生存率分別為71.1％、33.3％，差異顯著。 2.β-cat蛋白Westernblot結(jié)果：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級(jí)的光密度值分別為5888284±1839644、4656666±1857431、3843872±1481778；臨床分期Tis-T1及T2-T4分別為553887

12、7.44±2027129、4055126.588±1534466.18。Ⅰ級(jí)與Ⅲ級(jí)相比，差異有顯著性(P＜0.01)；正常膀胱上皮與腫瘤相比，差異顯著(P＜0.01)，正常膀胱移行上皮分別與Ⅱ、Ⅲ級(jí)腫瘤相比，差異顯著(P＜0.01)。Tis-T1與T2-T4相比，差異顯著(P＜0.05)；正常膀胱上皮與T2-T4相比，差異顯著(P＜0.01)。 3.RT-PCR結(jié)果：正常膀胱移行上皮為0.7695833±0.12，對(duì)應(yīng)的腫瘤標(biāo)本

13、為0.70125±0.09，兩者比較，差異有顯著性(P＜0.05)。Tis-T1組為0.742857±0.10，對(duì)應(yīng)的正常膀胱移行上皮為0.747857±0.12；T2-T4組為0.651±0.06，對(duì)應(yīng)的正常上皮為0.8±0.11。Tis-T1組與對(duì)應(yīng)的移行上皮標(biāo)本比較，無顯著差異(P＞0.05)；T2-T4組與對(duì)應(yīng)的移行上皮標(biāo)本比較，有顯著差異(P＜0.01)；Tis-T1組與T2-T4組相比有顯著性差異(P＜0.05) 結(jié)

14、論: 1.膀胱移行上皮癌中β-catenin存在異常表達(dá)，與腫瘤的病理分級(jí)無關(guān)，與臨床分期有關(guān)；β-catenin異常表達(dá)與預(yù)后不良有關(guān)；膀胱移行上皮癌中E-cad存在異常表達(dá)，與腫瘤的病理分級(jí)有關(guān)，與臨床分期有關(guān)；E-cad異常表達(dá)與預(yù)后不良有關(guān)。 2.膀胱移行細(xì)胞中β-catenin蛋白的表達(dá)與正常移行上皮相比，表達(dá)降低，隨著腫瘤的分級(jí)、分期的增高而下降。 3.β-catenin在膀胱腫瘤中的異常表達(dá)與腫瘤預(yù)