尸體腦組織降解代謝組學(xué)變化及其推斷死亡時(shí)間的研究.pdf

1、目的和意義：
　　準(zhǔn)確地推斷死亡時(shí)間(Postmortem Interval，PMI)一直是法醫(yī)學(xué)鑒定難題，也是一項(xiàng)歷史性的重要研究課題。本實(shí)驗(yàn)利用代謝組學(xué)、生物力學(xué)和形態(tài)學(xué)的理論和技術(shù)，探討在不同溫度情況下，家豬腦組織隨 PMI的時(shí)序性變化規(guī)律。
　　材料與方法：
　　屠宰場放血處死的成年家豬(約4個(gè)月齡，體重120~150 kg)，提取大腦組織，置于恒溫恒濕人工氣候箱內(nèi)自然腐敗。氣候箱溫度設(shè)置75％RH，溫度設(shè)置3

2、個(gè)處理組(15℃、25℃、30℃)，分別于0 h~96 h、0 h~84 h、0 h~72 h每隔6 h按“六定”標(biāo)準(zhǔn)化規(guī)范取材，備制腦組織勻漿液，進(jìn)行80%乙醇固定萃取-甲醇二次提取腦組織勻漿，以正亮氨基酸為內(nèi)標(biāo)，MTBSTFA衍生化后 GC-MS檢測，定性定量檢測各物質(zhì)峰。同時(shí)25℃組觀察記錄并標(biāo)準(zhǔn)化拍照裝置拍照各PMI腦組織大體形態(tài)變化，利用Photoshop CS6軟件計(jì)算RGB、R、G和B值；腦組織以4%甲醛固定，備制生物力學(xué)

3、檢測試件和常規(guī)制作腦組織石蠟切片，試件行生物力學(xué)縱軸單壓縮檢測，切片分別 HE、Glees神經(jīng)纖維染色，進(jìn)行量化病理學(xué)分析，計(jì)算腦白質(zhì)空白間隙 RE及 IOD。
　　所有結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SIMCA13.0.3、SPSS20.0、GraphPad Prism5等軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，包括PCA、PLS/OPLS-DA、散點(diǎn)圖、線性回歸和Kruskal-Wallis檢驗(yàn)等。
　　結(jié)果：
　　1、方法學(xué)考察
　

4、　改良微波輔助衍生化方法篩選最佳的反應(yīng)條件，反應(yīng)媒介為吡啶，于微波低火條件下衍生化反應(yīng)2 min?？疾靸x器精密度、線性、重復(fù)性和穩(wěn)定性等，大部分物質(zhì)的 RSD均在允許范圍內(nèi)(<15%)。
　　2、GC-MS檢測
　　(1)對(duì)各溫度組的可分辨峰進(jìn)行主成分分析以了解各個(gè)溫度組代謝物質(zhì)的降解規(guī)律和趨勢(shì)，得分散點(diǎn)圖結(jié)果示：除15℃組各時(shí)間組區(qū)分不明顯外，25℃和30℃組前后平臺(tái)期和窗口期的時(shí)間點(diǎn)可彼此分開，且30℃組變化比25℃組快

5、1個(gè)時(shí)間點(diǎn)(即6 h)。3個(gè)溫度組總的得分散點(diǎn)圖表明3個(gè)溫度組大部分時(shí)間點(diǎn)可相互區(qū)分開，部分交叉點(diǎn)的時(shí)間為各溫度組前平臺(tái)期。
　　(2)對(duì)各溫度組的可鑒定物質(zhì)峰進(jìn)行 PLS模型建立，得分散點(diǎn)圖結(jié)果示：不同溫度組存在不同的時(shí)間區(qū)分組，與 PCA結(jié)果相仿。3個(gè)溫度的排列試驗(yàn)圖均表明模型是可接受的，Y Perdicted Plot的回歸曲線分別為：Y15℃=0.9999X+0.2716(R2=0.8759)、Y25℃=1.0003X+0

6、.3163(R2=0.9273)和Y30℃=0.9989X+0.4899(R2=0.9552)。各溫度組VIP值法和Kruskal-Wallis檢驗(yàn)篩選出重要的生物標(biāo)志物質(zhì)數(shù)分別為11、18和15。以PMI為Y變量，溫度和各代謝物質(zhì)的相對(duì)定量為 X變量，建立 OPLS-DA模型的得分散點(diǎn)圖可明顯區(qū)分3個(gè)溫度組，而且，30℃組的大部分物質(zhì)的平均生成速率是15℃組的3.5~24倍；25℃組的大部分物質(zhì)的平均生成速率是15℃組的2.5~14倍

7、。
　　(3)線性回歸分析：各溫度組的大部分物質(zhì)的含量隨 PMI變化，回歸模型和參數(shù)檢驗(yàn)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，決定系數(shù)和估計(jì)標(biāo)準(zhǔn)誤大小與 PLS回歸模型的 VIP值大小順序相當(dāng)。各溫度組的逐步多元回歸方程分別為：15℃組 YPMI=2.241+22.51X琥珀酸+161.7X纈氨酸+125.3X5-氨基纈草酸(R2=0.840、SE=11.60)；25℃組 YPMI=6.610+16.29X十八烷酸+14.56X5-氨基纈草酸+5.51

8、7X丙氨酸(R2=0.909、SE=6.323)或 YPMI=15.78+9.690 X5-氨基纈草酸+86.45X亮氨酸–82.35X甘氨酸（R2=0.952、SE=4.271)；30℃組 YPMI=7.187+7.405 X琥珀酸+12.27X5-氨基纈草酸+6.798 X纈氨酸(R2=0.896、SE=6.611)。
　　3、生物力學(xué)和形態(tài)學(xué)變化
　　(1)大體形態(tài)和RGB值變化：隨著 PMI延長，腦組織從表面濕潤光滑

9、、血管紋理清晰，逐漸到灰暗無光澤、血管模糊，直至消失；從略有彈性、質(zhì)較軟、有形，逐漸到癱軟、腐敗液滲出、泡沫狀，直至完全液化；從無臭味到發(fā)臭，最后臭味又消失。RGB值與 PMI存在一定相關(guān)性，其中R值在0 h~30 h線性關(guān)系最好：YPMI=-0.314XR+55.41(R2=0.779、SE=4.898)
　　(2)組織生物力學(xué)形狀參數(shù)：甲醛固定腦組織的生物力學(xué)參數(shù)中，與PMI顯著相關(guān)的有極限載荷、平均力、最大模量、斷裂能量，均

10、呈時(shí)序性下降趨勢(shì)(P<0.05)，回歸方程分別是YPMI=-4.314X極限載荷/最大力+58.94(R2=0.888、SE=6.542)，YPMI=-3.990X斷裂能量+53.62(R2=0.770、SE=9.143)，YPMI=-1.535 X彈性模量+64.52(R2=0.883、SE=6.724)，YPMI=-10.03X平均力+58.66(R2=0.741、SE=9.695)。4個(gè)生物力學(xué)參數(shù)多元線性逐步回歸分析：YPMI=

11、62.99-1.666 X最大力-0.896X斷裂能量-0.494X彈性模量-1.786X平均力(R2=0.923、SE=5.256)?；貧w模型各參數(shù)t檢驗(yàn)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，比單因素回歸模型更優(yōu)。
　　(3) HE和Glees神經(jīng)纖維染色圖像分析中，其 RE和IOD值0 h~48 h期間 RE和IOD逐步增大，48 h~60 h較為平穩(wěn)甚至下降。HE染色的 RE和IOD擬合回歸方程分別為YPMI=13.45X+155

12、.8(R2=0.406、SE=14.24)，YPMI=12.97X+2.197×10^-7(R2=
　　0.440、SE=14.03)；Glees神經(jīng)纖維染色的 RE和IOD擬合回歸方程分別為：YPMI=14.99X+186.7(R2=0.401、SE=14.25)、YPMI=9.391X+2.731×10^-7(R2=0.638、SE=11.24)。
　　4、綜合分析
　　選取25℃組0 h~84 h腦組織多個(gè)檢測指

13、標(biāo)為自變量 X，PMI為因變量Y，進(jìn)行多元逐步線性回歸分析，選擇擬合度最好的回歸方程：YPMI=38.46–2.280X最大力+11.10Xγ-氨基丁酸–2.509X平均力(R2=0.976、SE=2.964)。
　　結(jié)論：
　　1、應(yīng)用GC-MS檢測出腦組織各類氨基酸、有機(jī)酸、脂肪酸等降解產(chǎn)物時(shí)序性變化的機(jī)制，實(shí)質(zhì)上是基于尸體器官組織死后的自溶腐敗過程，也是組織形態(tài)學(xué)和生物力學(xué)形狀參數(shù)時(shí)序性變化的構(gòu)效關(guān)系的物質(zhì)基礎(chǔ)，構(gòu)成了

14、腦尸體組織代謝組學(xué)、形態(tài)學(xué)和生物力學(xué)推斷PMI的理論依據(jù)。
　　2、GC-MS檢測出腦組織的多種腐敗產(chǎn)物與 PMI之間存在顯著相關(guān)性，，證實(shí)了代謝組學(xué)理論和技術(shù)推斷 PMI的可行性和準(zhǔn)確性，而且3個(gè)溫度組各個(gè)物質(zhì)其生成速率明顯不同，比值約為1:2.5~14:3.5~24。
　　3、應(yīng)用PCA和PLS/OPLS-DA等多元模式分析方法，進(jìn)行 PMI推斷模型建立的，可更好地了生化物質(zhì)降解趨勢(shì)和規(guī)律，提高 PMI推斷的準(zhǔn)確性。綜合