纖維素酶ChCe15A活性架構(gòu)中關(guān)鍵氨基酸的功能分析與其熒光淬滅動力學(xué)研究.pdf

1、木質(zhì)纖維素是地球上分布最廣、蘊藏量最豐富的可再生資源，實現(xiàn)木質(zhì)纖維素的高效轉(zhuǎn)化夠解決人類面臨的能源和資源問題，實現(xiàn)人類的可持續(xù)發(fā)展。在木質(zhì)纖維素的轉(zhuǎn)化過程中需要多種糖苷水解酶的協(xié)同作用，糖苷水解酶GH5家族被稱為“纖維素酶家族A”，在數(shù)量上是非常龐大的糖苷水解酶家族?；谛蛄幸恢滦?，GH5家族被分為51個亞家族。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)和結(jié)構(gòu)生物信息學(xué)的發(fā)展，基于序列和結(jié)構(gòu)信息的活性架構(gòu)序列譜對纖維素酶進行理性改造，有助于探究纖維素酶與底物之間的

2、結(jié)合、催化斷鍵和產(chǎn)物釋放機制，闡明其中的共性規(guī)律，為實現(xiàn)纖維素的高效轉(zhuǎn)化奠定堅實的理論和應(yīng)用基礎(chǔ)。本文以糖苷水解酶GH5-2亞家族的ChCel5A為研究對象，對其活性架構(gòu)中起關(guān)鍵作用的完全保守氨基酸和相對保守的芳香族氨基酸進行定點突變和理化性質(zhì)的分析，尋找纖維素酶降解底物時的規(guī)律。本文的研究內(nèi)容及主要結(jié)果如下:
　　1、對GH5-2亞家族的纖維素酶進行了生物信息學(xué)分析，找到完全保守氨基酸的N165、Y227和相對保守芳香族氨基酸W

3、61、Y203。
　　對整個GH5-2亞家族有結(jié)構(gòu)的酶分子進行了生理生化性質(zhì)的統(tǒng)計，顯示GH5-2亞家族的酶分子具有較寬的溫度和pH的適應(yīng)范圍。該家族的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)為Tm桶，即（β/α）8桶結(jié)構(gòu)，活性架構(gòu)具有較強的負(fù)電性，嗜熱酶的帶電性基本強于中溫酶和低溫酶的帶電性。根據(jù)活性架構(gòu)序列譜以及ChCel5A與底物距離為5(A)的原則，找到完全保守氨基酸N165、Y227和相對保守芳香族氨基酸W61、Y203進行研究，該項研究為后續(xù)的實驗工

4、作奠定了基礎(chǔ)。
　　2、對ChCel5A活性架構(gòu)中保守氨基酸進行了突變和功能分析，發(fā)現(xiàn)保守氨基酸的突變能夠改變酶分子的最小結(jié)合糖單元。
　　通過糖苷水解酶GH5家族的活性架構(gòu)序列譜中的N165和Y227,都位于-1位亞位點，推測對于維持酶活力具有非常重要的作用，因此通過定點突變和大腸桿菌異源表達(dá)的方法進行N165A和Y227A的功能分析。N165A和Y227A突變體的CMC酶活均降低90％以上，說明完全保守氨基酸對于維持酶分

5、子的催化活性具有至關(guān)重要的作用。對N165A和Y227A降解RAC的產(chǎn)物譜進行分析，發(fā)現(xiàn)隨著反應(yīng)時間的增加，主要產(chǎn)物是纖維二糖、纖維三糖和纖維四糖，而野生型蛋白的主要產(chǎn)物中沒有纖維四糖，說明N165A和Y227A突變體的最小結(jié)合糖單元不再是纖維四糖而是纖維五糖，說明完全保守氨基酸的突變能夠改變酶分子的最小結(jié)合糖單元以及作用模式。
　　3、通過突變和功能分析發(fā)現(xiàn)，ChCel5A活性架構(gòu)中-2亞位點氨基酸對維持酶功能具有更加重要的作用

6、。
　　W61位于ChCel5A活性架構(gòu)-2亞位點，Y203位于+1亞位點，是其活性架構(gòu)中的相對不保守氨基酸。W61Y的CMC酶活降低降低了72％。W61Y的Km升高，kcat降低，說明W61Y的突變使酶分子與底物間的結(jié)合力降低，產(chǎn)物釋放變慢。從結(jié)構(gòu)上分析，W61是ChCel5A活性架構(gòu)中5(A)范圍內(nèi)的氨基酸，將W61突變成Y后，其與-2位糖環(huán)中C6的距離為8.2(A)，其與底物失去了相互作用，最終影響了酶活;Y203W的CMC

7、酶活降低了68％，從結(jié)構(gòu)上分析，Y203與+1位的C3形成一個氫鍵，突變成W之后，W與底物不會形成氫鍵有利于產(chǎn)物釋放。Y203W的Km升高，kcat也升高，但kcat/Km降低，說明kcat的升高不足以彌補Km的升高對酶活造成的影響，從而酶活降低。-2亞位點W61Y的酶活改變較+1亞位點的Y203W明顯，且產(chǎn)物譜中降解四糖的能力減弱，因此-2亞位點對于維持酶活力具有重要的作用。
　　4、利用熒光光譜法測定了ChCel5A活性架構(gòu)中

8、亞位點氨基酸與底物的結(jié)合力，同時發(fā)現(xiàn)pNP類物質(zhì)不適宣作為底物來表征纖維素酶的性質(zhì)。
　　酶分子中的色氨酸可以被295nm的激發(fā)光激發(fā)，當(dāng)酶分子與底物相互作用后導(dǎo)致熒光淬滅，根據(jù)Stern-Volmer方程計算出色氨酸與底物之間的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合力。本文利用熒光光譜的方法測定了ChCel5A活性架構(gòu)中關(guān)鍵芳香族氨基酸(W61Y、W287A、Y203W)與三種底物(pNP、pNPC、CMC)的結(jié)合常數(shù)，分析了ChCel5A中單個芳香族