糖苷水角酶GH12家族活性架構(gòu)中關(guān)鍵氨基酸的功能分析.pdf

1、以纖維素為主要成分的植物生物質(zhì)是地球上最豐富的可再生資源，對木質(zhì)纖維素的高效開發(fā)利用越來越受到人們的重視。目前，人們對大量的纖維素酶認識卻存在不足，沒有任何普遍性規(guī)律存在，利用生物信息學(xué)統(tǒng)計分析酶分子的序列、結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系將有助于纖維素酶催化機制的研究，尋找其共性規(guī)律，從而奠定蛋白質(zhì)理性設(shè)計的理論基礎(chǔ)。本文利用結(jié)構(gòu)生物信息學(xué)展開了對GH12家族糖苷水解酶的研究，分析蛋白質(zhì)家族活性架構(gòu)序列譜，并對關(guān)鍵氨基酸進行定點設(shè)計，以期進一步闡

2、明酶分子結(jié)合機理與催化過程。本文的主要內(nèi)容以及結(jié)果如下:
　　 1.GH12家族糖苷水解酶活性架構(gòu)序列譜的生成及關(guān)鍵氨基酸分析
　　 GH12家族糖苷水解酶分布于真菌、細菌以及古菌中，構(gòu)建進化樹表明進化關(guān)系較遠，其拓撲結(jié)構(gòu)為β-果凍卷，活性架構(gòu)是馬鞍型的催化凹槽、有較強的負電性，催化殘基為兩個谷氨酸殘基。研究發(fā)現(xiàn)該家族蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)保守，有較好的重疊性，基于結(jié)構(gòu)比對生成了GH12家族糖苷水解酶活性架構(gòu)序列譜，并檢驗了其有效性

3、，構(gòu)建了一種快速的定位功能氨基酸殘基及其空間組合的變化規(guī)律的方法，具有家族特異性，大大縮小了序列空間搜索強度?；谠摷易寤钚约軜?gòu)序列譜中25個氨基酸殘基，篩選出其中10個較高保守性的關(guān)鍵氨基酸，推測其中的N95、D99、E116、M118、E200與催化有關(guān)，N20、W22與底物結(jié)合有關(guān)。
　　 2.GH12家族糖苷水解酶的異源表達及重組酶性質(zhì)的研究
　　 利用大腸桿菌與畢赤酵母兩種表達體系對GH12家族的纖維素酶EGⅢ

4、/Eg1A進行了異源表達，研究發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌體系胞外未誘導(dǎo)出蛋白EGⅢ，周質(zhì)空間只有極低的含量;通過大腸桿菌體系誘導(dǎo)的蛋白Eg1A分子量偏大，部分形成包涵體，酶活力降低10％;畢赤酵母表達體系則可以使兩種蛋白分泌性表達，酶活力接近于本源表達。實驗測定表明，Eg1A、EGⅢ對CMC反應(yīng)的最適pH分別為3.9和5.0，兩者最適溫度都為50℃。因此，畢赤酵母表達體系更適合于GH12家族纖維素酶的表達，為后續(xù)定點突變研究奠定了技術(shù)平臺。

5、　　 3.GH12家族糖苷水解酶活性架構(gòu)中關(guān)鍵氨基酸的丙氨酸篩選與性質(zhì)分析
　　 以GH12家族纖維素酶EGⅢ為代表，對活性架構(gòu)序列譜中部分關(guān)鍵氨基酸位點N20、Y60、D99、M118以及P129進行丙氨酸篩選，研究發(fā)現(xiàn)這些位點突變后均造成內(nèi)切纖維素酶活的降低，可見，這些位點在GH12家族糖苷水解酶降解纖維素過程中發(fā)揮著重要作用;同時不同突變體蛋白造成不同程度的酶活損失，也說明各氨基酸殘基在酶的活性架構(gòu)執(zhí)行不同的功能。由于這

6、些關(guān)鍵氨基酸都位于凹槽內(nèi)側(cè)且與糖鏈的一側(cè)發(fā)生相互作用，可以識別纖維素與木葡聚糖共同的局部結(jié)構(gòu)，突變體蛋白試驗表明兩種底物的酶活有相同的變化趨勢，驗證了這些關(guān)鍵氨基酸的空間組合應(yīng)是其識別不同底物共有的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。
　　 4.GH12家族糖苷水解酶活性架構(gòu)中決定多功能關(guān)鍵氨基酸的功能分析
　　 氨基酸殘基N20，Y60，D99丙氨酸篩選時酶活降低較為明顯，D99與親核基團E116形成氫鍵，突變?yōu)镈99A、D99E與D99N，分

7、析表明突變體蛋白均喪失了相關(guān)水解活性，證明GH12家族纖維素酶的催化機制應(yīng)為催化三聯(lián)體。突變體蛋白Y60A基本完全喪失相關(guān)的水解酶活，但Y60F卻基本維持原酶活，說明酪氨酸殘基發(fā)揮作用的是苯酚環(huán)，根據(jù)二面角推測此位點可能對于糖鏈在酶蛋白催化孔道中維持正確構(gòu)象與走向發(fā)揮重要作用。N20與纖維素鏈-2位糖環(huán)C2位上的羥基形成氫鍵，對于結(jié)合底物起著關(guān)鍵作用，N20D其酶解產(chǎn)物譜未變化，但酶活力降低48％，這種變化應(yīng)為氫鍵結(jié)合力減弱導(dǎo)致;N20