糖苷水角酶GH12家族活性架構中關鍵氨基酸的功能分析.pdf

1、以纖維素為主要成分的植物生物質是地球上最豐富的可再生資源，對木質纖維素的高效開發(fā)利用越來越受到人們的重視。目前，人們對大量的纖維素酶認識卻存在不足，沒有任何普遍性規(guī)律存在，利用生物信息學統(tǒng)計分析酶分子的序列、結構與功能之間的關系將有助于纖維素酶催化機制的研究，尋找其共性規(guī)律，從而奠定蛋白質理性設計的理論基礎。本文利用結構生物信息學展開了對GH12家族糖苷水解酶的研究，分析蛋白質家族活性架構序列譜，并對關鍵氨基酸進行定點設計，以期進一步闡

2、明酶分子結合機理與催化過程。本文的主要內容以及結果如下:
　　 1.GH12家族糖苷水解酶活性架構序列譜的生成及關鍵氨基酸分析
　　 GH12家族糖苷水解酶分布于真菌、細菌以及古菌中，構建進化樹表明進化關系較遠，其拓撲結構為β-果凍卷，活性架構是馬鞍型的催化凹槽、有較強的負電性，催化殘基為兩個谷氨酸殘基。研究發(fā)現(xiàn)該家族蛋白質結構保守，有較好的重疊性，基于結構比對生成了GH12家族糖苷水解酶活性架構序列譜，并檢驗了其有效性

3、，構建了一種快速的定位功能氨基酸殘基及其空間組合的變化規(guī)律的方法，具有家族特異性，大大縮小了序列空間搜索強度?；谠摷易寤钚约軜嬓蛄凶V中25個氨基酸殘基，篩選出其中10個較高保守性的關鍵氨基酸，推測其中的N95、D99、E116、M118、E200與催化有關，N20、W22與底物結合有關。
　　 2.GH12家族糖苷水解酶的異源表達及重組酶性質的研究
　　 利用大腸桿菌與畢赤酵母兩種表達體系對GH12家族的纖維素酶EGⅢ

4、/Eg1A進行了異源表達，研究發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌體系胞外未誘導出蛋白EGⅢ，周質空間只有極低的含量;通過大腸桿菌體系誘導的蛋白Eg1A分子量偏大，部分形成包涵體，酶活力降低10％;畢赤酵母表達體系則可以使兩種蛋白分泌性表達，酶活力接近于本源表達。實驗測定表明，Eg1A、EGⅢ對CMC反應的最適pH分別為3.9和5.0，兩者最適溫度都為50℃。因此，畢赤酵母表達體系更適合于GH12家族纖維素酶的表達，為后續(xù)定點突變研究奠定了技術平臺。

5、　　 3.GH12家族糖苷水解酶活性架構中關鍵氨基酸的丙氨酸篩選與性質分析
　　 以GH12家族纖維素酶EGⅢ為代表，對活性架構序列譜中部分關鍵氨基酸位點N20、Y60、D99、M118以及P129進行丙氨酸篩選，研究發(fā)現(xiàn)這些位點突變后均造成內切纖維素酶活的降低，可見，這些位點在GH12家族糖苷水解酶降解纖維素過程中發(fā)揮著重要作用;同時不同突變體蛋白造成不同程度的酶活損失，也說明各氨基酸殘基在酶的活性架構執(zhí)行不同的功能。由于這

6、些關鍵氨基酸都位于凹槽內側且與糖鏈的一側發(fā)生相互作用，可以識別纖維素與木葡聚糖共同的局部結構，突變體蛋白試驗表明兩種底物的酶活有相同的變化趨勢，驗證了這些關鍵氨基酸的空間組合應是其識別不同底物共有的結構基礎。
　　 4.GH12家族糖苷水解酶活性架構中決定多功能關鍵氨基酸的功能分析
　　 氨基酸殘基N20，Y60，D99丙氨酸篩選時酶活降低較為明顯，D99與親核基團E116形成氫鍵，突變?yōu)镈99A、D99E與D99N，分

7、析表明突變體蛋白均喪失了相關水解活性，證明GH12家族纖維素酶的催化機制應為催化三聯(lián)體。突變體蛋白Y60A基本完全喪失相關的水解酶活，但Y60F卻基本維持原酶活，說明酪氨酸殘基發(fā)揮作用的是苯酚環(huán)，根據二面角推測此位點可能對于糖鏈在酶蛋白催化孔道中維持正確構象與走向發(fā)揮重要作用。N20與纖維素鏈-2位糖環(huán)C2位上的羥基形成氫鍵，對于結合底物起著關鍵作用，N20D其酶解產物譜未變化，但酶活力降低48％，這種變化應為氫鍵結合力減弱導致;N20