棉花纖維伸長相關基因GbEXPA2和GbEXPATR的克隆及功能分析.pdf

1、棉纖維是世界上最重要的天然紡織纖維。它由胚珠外表皮細胞分化而來，是高度伸長、增厚、無分支的單細胞表皮毛。成熟棉花纖維的品質主要由其細胞壁的特性所決定，因此對棉花纖維細胞壁相關基因的研究，其意義就顯得尤為重要，不僅能豐富現(xiàn)有棉花纖維細胞壁的研究領域，還能為纖維品質的改良提供新的育種材料。本實驗室在前期研究中，比較相同發(fā)育時期海島棉3-79和陸地棉TM-1纖維表達譜時發(fā)現(xiàn)了一個在海島棉和陸地棉中共同表達的細胞壁松弛蛋白基因GbEXPA2和一

2、個海島棉特異表達的細胞壁松弛蛋白基因GbEXPATR。經序列分析發(fā)現(xiàn)，GbEXPA2具有完整細胞壁松弛蛋白基因的結構（信號肽和兩個結構域），而GbEXPATR只具有信號肽和第一個結構域，缺少C末端多糖綁定的結構域?；谝陨涎芯浚菊撐倪M一步深入分析了這兩個基因的功能。
　　1.海島棉特異表達的細胞壁松弛蛋白基因GbEXPATR起源于A基因組
　　通過分析GbEXPA2和GbEXPATR基因的特異SNP位點，發(fā)現(xiàn)GbEXPA2

3、與Gr-contig12和Gh-contig29-2的SNP位點高度相似，GbEXPATR與Ga-contig4和Gh-contig29-1的SNP位點相似，即GbEXPA2來自海島棉的DT亞組，而GbEXPATR來自AT亞組。進一步分析表明，在Gh、Ga、Gr中不存在缺失第二個結構域的細胞壁松弛蛋白，因此推測GbEXPATR可能是在海島棉多倍體加倍過程中或之后產生的。
　　2.proGbEXPA2和proGbEXPATR是表皮毛

4、特異表達的啟動子且proGbEXPA2受GA和ABA調控
　　通過Genome-Walking的方法從海島棉3-79中克隆到長839 bp的GbEXPA2啟動子和長1405 bp的GbEXPATR啟動子。序列比對表明二者具有較高的相似度。分別將proGbEXPA2和proGbEXPATR與GUS報告基因融合轉化棉花和擬南芥，組織化學染色表明這兩個啟動子具有相似的表達模式，在纖維伸長期和擬南芥表皮毛中高量、優(yōu)勢表達，在根、莖、葉等其

5、它組織沒有表達。與proGbEXPATR不同的是，proGbEXPA2在棉花幼嫩葉子的表皮毛中也有表達。進一步通過GbEXPA2啟動子5'端的逐步缺失，發(fā)現(xiàn)長度為461 bp的proGbEXPA2能夠驅動下游GUS基因在纖維和擬南芥表皮毛中表達，而長度為258bp則不足以驅動其表達，暗示了461bp的啟動子片段是proGbEXPA2的核心啟動子區(qū)域。用GA3和ABA處理proGbEXPA2全長和截短啟動子的轉基因擬南芥幼苗，GUS染色結

6、果顯示:proGbEXPA2經GA3處理后，GUS表達量明顯上調;而ABA處理則使GUS表達量顯著下調。
　　3.下調纖維中EXPA的表達后，纖維變短變粗;而超量表達GbEXPATR則促進纖維變長變細
　　為了驗證細胞壁松弛蛋白基因EXPA在纖維發(fā)育中的功能，通過RNAi技術獲得了EXPA表達量下調的五個轉基因株系，對其成熟纖維品質檢測發(fā)現(xiàn)纖維長度明顯變短、馬克隆值升高、斷裂比強度下降。隨后又檢測了EXPA-RNAi成熟纖維

7、細胞壁的厚度及晶體纖維素的含量，結果顯示下調纖維中EXPA的表達后，纖維細胞壁增厚、晶體纖維素含量升高。進一步為了研究GbEXPA2和GbEXPATR對纖維發(fā)育的影響，構建了它們超量表達載體并轉化陸地棉YZ1，分別獲得3個高量表達的轉基因株系。分析表明，超量表達GbEXPA2不影響纖維細胞的伸長，但能使其馬克隆值上升、成熟纖維的細胞壁增厚、晶體纖維素含量升高;而超量表達GbEXPATR則能促進纖維品質的提高，使其更長、更細、更強。通過雜

8、交手段將35S∷GbEXPATR導入到EXPA-3' UTR RNAi植株中，發(fā)現(xiàn)EXPA-3' UTR RNAi短纖維的表型在F1代被完全恢復，表明在纖維發(fā)育中全長的EXPA能被GbEXPATR功能互補。
　　4.GbEXPATR通過推遲次生壁合成相關基因的表達進而改變細胞壁成分來促進纖維的伸長
　　對EXPA-3' UTR RNAi株系10天纖維的RNA-seq分析表明抑制EXPA的表達不影響纖維細胞其它基因的表達，暗示

9、了EXPA是一類下游基因。qRT-PCR分析其15和20天纖維次生壁相關基因CTLs、CESAs和GhTLP1的表達發(fā)現(xiàn)，與對照相比沒有一致的變化。在GbEXPA2和GbEXPATR超量表達株系15天的纖維中，這些次生壁相關基因被下調表達;20天，這些基因在GbEXPA2中的表達變化不明顯，但在GbEXPATR中仍有下降。用單糖關聯(lián)分析的方法對轉基因株系20天纖維細胞壁成分分析結果表明，在RNAi和GbEXPA2株系中纖維素含量顯著升高