棉花GhWRKY25基因的克隆及功能分析.pdf

1、植物不能像動物一樣移動，所以在整個生長發(fā)育過程中會不斷遭受各種各樣的脅迫刺激。在長期的進化過程中，植物本身形成了一套精密而復雜的防御機制，其中轉錄調控系統(tǒng)及信號傳遞網絡發(fā)揮了重要作用。WRKY轉錄因子是植物中最大的轉錄因子家族之一，通過調控靶基因啟動子區(qū)的W-box順式作用元件調控靶基因的表達?；诨蚪M測序技術的不斷完善，甜薯SPF1作為第一個WRKY轉錄因子被報道后，其他物種中WRKY家族成員被大量發(fā)現鑒定。通過對WRKY轉錄因子功

2、能的研究發(fā)現WRKY轉錄因子在植物防御反應、非生物脅迫、生長發(fā)育及代謝過程中都發(fā)揮了重要作用。對WRKY轉錄因子的研究多集中在模式生物擬南芥、水稻中，在經濟作物棉花中研究較少。可能基于Ⅰ類WRKY轉錄因子是WRKY轉錄因子進化的祖先，對Ⅰ類WRKY轉錄因子功能的研究要遠少于對Ⅱ類和Ⅲ類WRKY轉錄因子的研究。因此，本研究以陸地棉（Gossypium hirsutum L.）（魯棉22）為材料，利用同源克隆的方法分離得到一個Ⅰ類WRKY基

3、因，命名為GhWRKY25，并對其進行生物學功能分析，具體研究結果如下:
　　(1)基因全長序列分析表明，該基因cDNA全長為1798bp，包括75bp的5'非編碼區(qū)（Untranslated region，UTR），172bp的3'UTR和1551bp的開放閱讀框(Open readingframe, ORF)。ORF編碼一個516個氨基酸的多肽，預測其分子量大約為56.349kDa，pI值為8.47。對該基因編碼的氨基酸序列進

4、行同源比對及聚類分析，結果表明棉花GhWRKY25與CsWRKY4、JcWRKY6、GhWRKY3和TcWRKY3具有較高同源性，且這些基因都屬于Ⅰ類WRKY轉錄因子。對基因組DNA序列分析發(fā)現，GhWRKY25基因組DNA含有3個內含子，且第一個內含子的插入位點符合Ⅰ類WRKY轉錄因子的保守插入位點。以上結果表明，本研究分離得到的是棉花Ⅰ類WRKY轉錄因子，并命名為GhWRKY25。
　　(2)采用反向PCR的方法分離得到792

5、bp的GhWRKY25的啟動子序列。利用在線軟件PlantCARE分析，表明該啟動子序列上含有與低溫、干旱、胚乳及赤霉素相關的順式作用元件，說明GhWRKY25可能具有多樣化功能。
　　(3)采用RT-PCR的方法對GhWRKY25基因在棉花受到不同脅迫時的表達特性進行了研究。結果表明，GhWRKY25的轉錄水平受高鹽和低溫(4℃)誘導，受聚乙二醇(PEG)和機械損傷抑制;激素信號分子GA3、6-BA、ABA和SA可強烈誘導GWR

6、KY25基因的表達，但是GhWRKY25的轉錄水平基本不受ET和MeJA影響。以上結果表明GhWRKY25可能參與不同的信號途徑，在植物生長發(fā)育及脅迫應答過程中發(fā)揮重要作用。
　　(4)構建35S-GhWRKY25∷GFP融和表達載體，采用基因槍轉化法瞬時轉化洋蔥表皮細胞，利用熒光顯微鏡觀察GFP熒光，發(fā)現空GFP對照載體在細胞質和細胞核中均有熒光，但是融和載體只在細胞核中有熒光，說明GhWRKY25定位在細胞核中，是典型的WRK

7、Y轉錄因子。
　　(5)為研究GhWRKY25的功能，構建GhWRKY25與正義植物表達載體pBI121的重組載體pBI121-GhWRKY25，采用農桿菌介導法轉化本生煙（Nicotiana benthamiana）。通過擴增部分CaMV35S啟動子序列鑒定陽性植株。對部分轉基因本生煙進行RT-PCR分析，選取GhWRKY25表達量高、中、低的三個株系用于功能分析實驗。干旱脅迫處理后，與野生型本生煙相比，轉基因植株降低了對干旱脅

8、迫的抗性:在含200mM甘露醇的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)7d后，轉基因煙草種子的萌發(fā)率比野生型種子低10％-20％;萌發(fā)后轉基因幼苗在含200mM甘露醇的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)14d后，根長比野生型幼苗短5-8mm;干旱處理營養(yǎng)生長期植株后，轉基因植株的存活率比野生型植株低30％-40％，葉片含水量低15％-20％，蒸騰水損失速率高10％-15％。綜合以上結果表明超表達GhWRKY25降低了干旱脅迫抗性。
　　(6)干旱處理后，超表達GhWRK

9、Y25的轉基因植株中H2O2和O2-含量增加，與ROS產生相關的基因的表達量增加，與ROS清除相關基因的表達量降低，各種抗氧化酶的活性降低。以上結果表明，GhWRKY25參與了ROS信號途徑。
　　(7)超表達GhWRKY25的轉基因植株提高了對高鹽脅迫的抗性:在含200mM NaCl的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)7天后，轉基因種子的萌發(fā)率比野生型高20％-30％;萌發(fā)后的轉基因幼苗在含200mM NaCl的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)14天后根長比野生

10、型長5-10mm;轉基因和野生型煙草的葉圓片在不同濃度NaCl水溶液中處理72h后，野生型葉圓片嚴重褪綠卷曲，轉基因葉圓片癥狀較輕。以上結果說明GhWRKY25可能正調控高鹽脅迫抗性。
　　(8)超表達GhWRKY25的轉基因植株降低了對灰霉菌的抗性:灰霉菌處理3d后，轉基因植株離體葉片菌絲生長更旺盛，菌斑直徑比野生型離體葉片大5-12mm，葉綠素含量低于野生型離體葉片;與野生型植株相比，灰霉菌處理后轉基因植株中與SA信號途徑相關