棉花GhWRKY25基因的克隆及功能分析.pdf

1、植物不能像動(dòng)物一樣移動(dòng)，所以在整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中會(huì)不斷遭受各種各樣的脅迫刺激。在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中，植物本身形成了一套精密而復(fù)雜的防御機(jī)制，其中轉(zhuǎn)錄調(diào)控系統(tǒng)及信號(hào)傳遞網(wǎng)絡(luò)發(fā)揮了重要作用。WRKY轉(zhuǎn)錄因子是植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，通過(guò)調(diào)控靶基因啟動(dòng)子區(qū)的W-box順式作用元件調(diào)控靶基因的表達(dá)?；诨蚪M測(cè)序技術(shù)的不斷完善，甜薯SPF1作為第一個(gè)WRKY轉(zhuǎn)錄因子被報(bào)道后，其他物種中WRKY家族成員被大量發(fā)現(xiàn)鑒定。通過(guò)對(duì)WRKY轉(zhuǎn)錄因子功

2、能的研究發(fā)現(xiàn)WRKY轉(zhuǎn)錄因子在植物防御反應(yīng)、非生物脅迫、生長(zhǎng)發(fā)育及代謝過(guò)程中都發(fā)揮了重要作用。對(duì)WRKY轉(zhuǎn)錄因子的研究多集中在模式生物擬南芥、水稻中，在經(jīng)濟(jì)作物棉花中研究較少?？赡芑冖耦?lèi)WRKY轉(zhuǎn)錄因子是WRKY轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)化的祖先，對(duì)Ⅰ類(lèi)WRKY轉(zhuǎn)錄因子功能的研究要遠(yuǎn)少于對(duì)Ⅱ類(lèi)和Ⅲ類(lèi)WRKY轉(zhuǎn)錄因子的研究。因此，本研究以陸地棉（Gossypium hirsutum L.）（魯棉22）為材料，利用同源克隆的方法分離得到一個(gè)Ⅰ類(lèi)WRKY基

3、因，命名為GhWRKY25，并對(duì)其進(jìn)行生物學(xué)功能分析，具體研究結(jié)果如下:
　　(1)基因全長(zhǎng)序列分析表明，該基因cDNA全長(zhǎng)為1798bp，包括75bp的5'非編碼區(qū)（Untranslated region，UTR），172bp的3'UTR和1551bp的開(kāi)放閱讀框(Open readingframe, ORF)。ORF編碼一個(gè)516個(gè)氨基酸的多肽，預(yù)測(cè)其分子量大約為56.349kDa，pI值為8.47。對(duì)該基因編碼的氨基酸序列進(jìn)

4、行同源比對(duì)及聚類(lèi)分析，結(jié)果表明棉花GhWRKY25與CsWRKY4、JcWRKY6、GhWRKY3和TcWRKY3具有較高同源性，且這些基因都屬于Ⅰ類(lèi)WRKY轉(zhuǎn)錄因子。對(duì)基因組DNA序列分析發(fā)現(xiàn)，GhWRKY25基因組DNA含有3個(gè)內(nèi)含子，且第一個(gè)內(nèi)含子的插入位點(diǎn)符合Ⅰ類(lèi)WRKY轉(zhuǎn)錄因子的保守插入位點(diǎn)。以上結(jié)果表明，本研究分離得到的是棉花Ⅰ類(lèi)WRKY轉(zhuǎn)錄因子，并命名為GhWRKY25。
　　(2)采用反向PCR的方法分離得到792

5、bp的GhWRKY25的啟動(dòng)子序列。利用在線(xiàn)軟件PlantCARE分析，表明該啟動(dòng)子序列上含有與低溫、干旱、胚乳及赤霉素相關(guān)的順式作用元件，說(shuō)明GhWRKY25可能具有多樣化功能。
　　(3)采用RT-PCR的方法對(duì)GhWRKY25基因在棉花受到不同脅迫時(shí)的表達(dá)特性進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，GhWRKY25的轉(zhuǎn)錄水平受高鹽和低溫(4℃)誘導(dǎo)，受聚乙二醇(PEG)和機(jī)械損傷抑制;激素信號(hào)分子GA3、6-BA、ABA和SA可強(qiáng)烈誘導(dǎo)GWR

6、KY25基因的表達(dá)，但是GhWRKY25的轉(zhuǎn)錄水平基本不受ET和MeJA影響。以上結(jié)果表明GhWRKY25可能參與不同的信號(hào)途徑，在植物生長(zhǎng)發(fā)育及脅迫應(yīng)答過(guò)程中發(fā)揮重要作用。
　　(4)構(gòu)建35S-GhWRKY25∷GFP融和表達(dá)載體，采用基因槍轉(zhuǎn)化法瞬時(shí)轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細(xì)胞，利用熒光顯微鏡觀察GFP熒光，發(fā)現(xiàn)空GFP對(duì)照載體在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均有熒光，但是融和載體只在細(xì)胞核中有熒光，說(shuō)明GhWRKY25定位在細(xì)胞核中，是典型的WRK

7、Y轉(zhuǎn)錄因子。
　　(5)為研究GhWRKY25的功能，構(gòu)建GhWRKY25與正義植物表達(dá)載體pBI121的重組載體pBI121-GhWRKY25，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化本生煙（Nicotiana benthamiana）。通過(guò)擴(kuò)增部分CaMV35S啟動(dòng)子序列鑒定陽(yáng)性植株。對(duì)部分轉(zhuǎn)基因本生煙進(jìn)行RT-PCR分析，選取GhWRKY25表達(dá)量高、中、低的三個(gè)株系用于功能分析實(shí)驗(yàn)。干旱脅迫處理后，與野生型本生煙相比，轉(zhuǎn)基因植株降低了對(duì)干旱脅

8、迫的抗性:在含200mM甘露醇的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)7d后，轉(zhuǎn)基因煙草種子的萌發(fā)率比野生型種子低10％-20％;萌發(fā)后轉(zhuǎn)基因幼苗在含200mM甘露醇的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)14d后，根長(zhǎng)比野生型幼苗短5-8mm;干旱處理營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期植株后，轉(zhuǎn)基因植株的存活率比野生型植株低30％-40％，葉片含水量低15％-20％，蒸騰水損失速率高10％-15％。綜合以上結(jié)果表明超表達(dá)GhWRKY25降低了干旱脅迫抗性。
　　(6)干旱處理后，超表達(dá)GhWRK

9、Y25的轉(zhuǎn)基因植株中H2O2和O2-含量增加，與ROS產(chǎn)生相關(guān)的基因的表達(dá)量增加，與ROS清除相關(guān)基因的表達(dá)量降低，各種抗氧化酶的活性降低。以上結(jié)果表明，GhWRKY25參與了ROS信號(hào)途徑。
　　(7)超表達(dá)GhWRKY25的轉(zhuǎn)基因植株提高了對(duì)高鹽脅迫的抗性:在含200mM NaCl的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)7天后，轉(zhuǎn)基因種子的萌發(fā)率比野生型高20％-30％;萌發(fā)后的轉(zhuǎn)基因幼苗在含200mM NaCl的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)14天后根長(zhǎng)比野生

10、型長(zhǎng)5-10mm;轉(zhuǎn)基因和野生型煙草的葉圓片在不同濃度NaCl水溶液中處理72h后，野生型葉圓片嚴(yán)重褪綠卷曲，轉(zhuǎn)基因葉圓片癥狀較輕。以上結(jié)果說(shuō)明GhWRKY25可能正調(diào)控高鹽脅迫抗性。
　　(8)超表達(dá)GhWRKY25的轉(zhuǎn)基因植株降低了對(duì)灰霉菌的抗性:灰霉菌處理3d后，轉(zhuǎn)基因植株離體葉片菌絲生長(zhǎng)更旺盛，菌斑直徑比野生型離體葉片大5-12mm，葉綠素含量低于野生型離體葉片;與野生型植株相比，灰霉菌處理后轉(zhuǎn)基因植株中與SA信號(hào)途徑相關(guān)