胡楊PeuAZF2基因的克隆和功能分析.pdf

1、C2H2型鋅指蛋白（C2H2-ZFPs）是植物中一類非常重要的轉(zhuǎn)錄因子家族，不僅調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育，而且參與植物多種生物和非生物脅迫響應(yīng)。本研究以抗逆模式林木樹種—胡楊為研究對象，通過blast以及Pfam鑒定，從胡楊基因組中鑒定出78個編碼C2H2-ZFPs的基因，對其中的PeuAZF2基因進(jìn)行了克隆鑒定以及轉(zhuǎn)基因異源表達(dá)分析，主要研究結(jié)果如下：
　?。?）系統(tǒng)進(jìn)化分析：根據(jù)擬南芥C2H2型鋅指轉(zhuǎn)錄因子家族的基因序列，在胡楊基因

2、組中blast其同源序列，并使用Pfam進(jìn)一步確認(rèn)鋅指功能結(jié)構(gòu)域，最終鑒定出78個胡楊C2H2-ZFP基因，含有1~5個鋅指結(jié)構(gòu)域，被長度不同的間隔區(qū)分開?；诤鷹頒2H2-ZFP基因序列構(gòu)建NJ樹，發(fā)現(xiàn)胡楊78個C2H2-ZFP基因可以分為4組（I、II、III和IV），分別包含3，15，33，27個基因成員，每組之間基因的外顯子數(shù)量保守，但鋅指結(jié)構(gòu)域數(shù)量和保守motif數(shù)量差異顯著。系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)，PeuAZF2、新疆楊PalAZ

3、F2以及擬南芥AtAZF2基因?qū)儆谥毕低椿颉?br>　?。?）楊樹AZF2基因結(jié)構(gòu)分析和功能預(yù)測：轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)顯示，胡楊PeuAZF2在鹽脅迫下表達(dá)顯著上調(diào)。PeuAZF2是C2H2-ZFPs家族的一員，含有豐富的保守motif，位于Ⅳ組?；蚩寺〗Y(jié)果顯示，PeuAZF2基因編碼區(qū)長度為753bp，而新疆楊PalAZF2長度為756bp，兩個基因編碼的蛋白序列相似性為93.2％，有17個氨基酸差異位點(diǎn)。結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)PeuAZF2和Pa

4、lAZF2均含有兩個鋅指結(jié)構(gòu)域，屬于C2H2鋅指蛋白家族中的C1亞類；每個鋅指結(jié)構(gòu)域中都含有QALGGH保守基序，也屬于Q型C2H2鋅指蛋白。鹽脅迫表達(dá)模式分析發(fā)現(xiàn)，中度鹽處理時（150mM NaCl），PeuAZF2和PalAZF2在各組織中表達(dá)變化不顯著；高鹽處理時（300mM NaCl），PeuAZF2在胡楊根中表達(dá)顯著上調(diào)，而PalAZF2則在新疆楊葉片中表達(dá)顯著上調(diào)。表明兩個直系同源基因在各自物種中的表達(dá)模式差異顯著。

5、　?。?）楊樹AZF2基因可能參與了根的發(fā)育。通過轉(zhuǎn)基因方法分別將胡楊PeuAZF2在新疆楊中超表達(dá)，以及用CRISPR-Cas9方法將新疆楊PalAZF2定點(diǎn)敲除，構(gòu)建35S::PeuAZF2和palazf2兩種轉(zhuǎn)基因新疆楊植株。比較兩種轉(zhuǎn)基因植株的根生長情況，生根時間長短為palazf2＞W(wǎng)T＞35S::PeuAZF2；側(cè)根數(shù)目出現(xiàn)顯著差異：35S::PeuAZF2＞W(wǎng)T＞palazf2。表明PeuAZF2在新疆楊中超表達(dá)之后，可以

6、加快轉(zhuǎn)基因新疆楊的根生長，尤其是促進(jìn)側(cè)根的生長；而敲除PalAZF2的突變體植株的生根速度減慢。推測PeuAZF2基因與根的生長有關(guān)，參與調(diào)控胡楊的生長發(fā)育。
　?。?）PeuAZF2超表達(dá)提高了轉(zhuǎn)基因新疆楊的鹽耐受性。為了驗(yàn)證AZF2基因在植物抗逆過程中的作用，對WT、palazf2和35S::PeuAZF2進(jìn)行鹽處理后，發(fā)現(xiàn)WT和palazf2的側(cè)根生長受到抑制，而35S::PeuAZF2的生根時間和側(cè)根數(shù)目沒有顯著地改變，而

7、且葉中脯氨酸和可溶性糖的含量顯著上升，高于同濃度鹽處理下WT和palazf2中的含量。35S::PeuAZF2葉片黃化程度也比同濃度鹽處理下WT和palazf2的黃化程度小，PSⅡ最大光化學(xué)效率Fv/Fm沒有顯著變化，而WT和palazf2的Fv/Fm顯著降低。結(jié)果表明35S::PeuAZF2具有更強(qiáng)的鹽耐受性。
　　綜上所述，PeuAZF2是一個C2H2雙鋅指基因，在胡楊根中受鹽脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，在新疆楊中超表達(dá)后，可以增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植