復合抗腫瘤活性珊瑚羥基磷灰石人工骨的研制及實驗研究.pdf

1、一、復合抗腫瘤活性珊瑚羥基磷灰石人工骨的制備及緩釋實驗 為研究抗腫瘤藥物順鉑(cis-diamminedichloroplatinum，CDDP)載入后其在CHA的分布，復合順鉑后CHA作為緩釋載體對CDDP的體內外緩釋作用。 方法： l、將CHA浸入0.6mg/ml的順鉑磷酸鹽溶液中快速振蕩30s后負壓靜置24h，取出CHA利用低溫冷凍干燥凍干。分別將0.5g、0.2g、0.1g順鉑用1ml二甲基亞砜(dime

2、thyl sulphoxide，DMSO)配成溶液后，再加入上述人工骨后再低溫凍干。掃描電鏡分析復合人工骨斷面的孔隙及順鉑的分布情況，用能譜分析了解人工骨內部所復合順鉑的含量。 2、以復合20％順鉑的CCHA為實驗對象，將CCHA樣本避光浸入10mmo/L的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer，PB)中37℃、30轉/分浸泡振蕩，每2天更換10ml磷酸鹽緩沖液。 3、利用3％戊巴比妥鈉(30mg/kg)將SD大

3、鼠麻醉后，經手術將100mg CCHA顆粒經手術植入SD大鼠背部肌袋中，術后定期取材時行大體觀察、X線攝片檢查，觀察動物重要臟器的一般情況，材料及周圍組織有無感染等不良反應，取動物靜脈血和復合人工骨植入處周圍l cm及1cm-2cm范圍的肌肉組織勻漿后檢測順鉑含量。 4、利用高效液相色譜法檢測體外緩釋試驗浸提液、體內緩釋試驗肌肉組織及血液中順鉑的濃度。 結果顯示： l、順鉑在CHA孔隙內分布均勻，CHA的孔隙結構

4、未改變； 2、利用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)檢測體外浸提液、動物靜脈血及組織勻漿液中的順鉑濃度結果示順鉑和內標液的保留時間分別為4.6 min和7.5 min，兩者分離效果良好。 3、體外緩釋液中前2周順鉑出現快速釋放，體外浸提液中順鉑的濃度極高(2周時濃度為753.01±64.89)；至12周其順鉑濃度仍達到134.54±9.88μg/ml。

5、 4、動物植入CCHA后局部較長時間內可維持較高順鉑濃度，隨著時間的延長及與人工骨的距離增加局部的順鉑濃度呈下降趨勢，距離人工骨1cm-2cm內的的順鉑濃度低于人工骨周圍1cmm組織內順鉑濃度，除7d時兩組間比較無顯著性差異外(P=0.06)，其余時間兩者間比較存在顯著性差異。 5、CCHA植入后動物血液中順鉑的濃度穩(wěn)定在較低水平，平均不超過17μg/ml，遠低于體內緩釋試驗中局部組織中的順鉑濃度。 6、動物各重

6、要臟器大體及組織切片示CCHA植入后對動物機體無不良影響。小結：CCHA具有良好的緩釋效能，可在局部維持一定時間高藥物濃度。 小結：CCHA具有良好的緩釋效能，可在局部維持一定時間高藥物濃度。 二、復合人工骨體外抗腫瘤實驗研究 CCHA作為抗腫瘤人工骨的體外抑制腫瘤細胞作用，為進一步行體內抗腫瘤實驗研究及臨床應用提供理論依據。為了使CCHA更加適合臨床相關骨腫瘤的應用，我們首先從臨床取得明確診斷為骨巨細胞瘤及乳腺

7、腺癌骨轉移標本進行原代細胞培養(yǎng)，成功獲取骨巨細胞瘤及骨轉移乳腺腺癌原代培養(yǎng)瘤細胞，通過對原代培養(yǎng)瘤細胞進行光鏡、電鏡下形態(tài)學觀察并與國內外文獻報道結果相比較，原代培養(yǎng)細胞離心后行常規(guī)病理切片HE染色、免疫組織/細胞化學檢測及接種于裸鼠建立腫瘤模型后取得的瘤結節(jié)組織切片HE染色與臨床組織標本的病理切片進行對比，對瘤細胞進行鑒定，確定實驗所培養(yǎng)的細胞為所需的瘤細胞。再明確成功獲取上述兩種腫瘤原代培養(yǎng)瘤細胞基礎上選用四肢常見骨惡性腫瘤一骨肉瘤

8、細胞株U-2OS，脊柱轉移瘤中其他最常見的腫瘤．人高轉移性肺腺癌細胞株SPCA-1、前列腺癌骨轉移細胞株PC-3、人高轉移性結腸腺癌細胞株LOVO細胞株為實驗對象。將第一部分實驗所得的CCHA及CHA體外緩釋液凍干粉再用與其凍干前相同體積的培養(yǎng)基溶解后作用于培養(yǎng)的瘤細胞，其中CHA的體外緩釋液為對照組，光鏡下觀察浸提液對瘤細胞的作用情況，并利用四唑鹽(MTT)比色法檢測其對上述細胞的抑制率。結果發(fā)現，對照CHA組浸提液對瘤細胞生長沒有明

9、顯的抑制作用，再次說明自制的CHA具有良好的生物相容性；實驗CCHA組8周內不同時間的浸提液對上述6種瘤細胞均有不同程度的抑制作用，加入浸提液后各系瘤細胞生長均受到不同程度的抑制，細胞皺縮，部分細胞崩解死亡；MTT結果顯示乳腺腺癌原代培養(yǎng)細胞、肺腺癌SPCA-1、骨肉瘤細胞株U-2OS及結腸腺癌LOVO細胞株對CCHA浸提液較敏感，8周內浸提液的抑制率均超過50％。 小結：CCHA在體外對多系骨相關腫瘤細胞具有良好的抑制作用。

10、 三、復合人工骨體內抗腫瘤實驗 進一步研究在體內狀態(tài)下CCHA人工骨的抗腫瘤活性。利用骨巨細胞瘤原代培養(yǎng)細胞、骨肉瘤細胞株U-2OS、肺癌細胞株SPCA-1、前列腺癌細胞株PC-3、結腸腺癌LOVO細胞株及乳腺癌原代培養(yǎng)瘤細胞接種于裸鼠建立腫瘤模型，結果示骨巨細胞瘤成瘤率較低且瘤結節(jié)生長較慢，本實驗中共20個接種點僅成瘤4個瘤結節(jié)。乳腺癌腫瘤模型未建立成功，其余腫瘤成瘤率較高，其中肺癌及結腸腺癌瘤結節(jié)生長較快。在瘤結節(jié)成瘤

11、后10天，經手術將實驗組CCHA及對照組CHA人工骨顆粒嵌入裸鼠腫瘤模型的瘤結節(jié)內，予相同條件下培養(yǎng)，觀察動物在人工骨植入前后的一般活動、局部傷口、瘤結節(jié)大小等情況，術后10天處死取材，再觀察裸鼠心臟、肝臟、腎臟及肺等重要臟器的顏色、大小及行組織切片常規(guī)H-E染色了解人工骨植入是否對裸鼠機體存在損傷作用，是否存在遠處轉移等情況。比較對照組及實驗組人工骨植入前后瘤結節(jié)體積大小的變化，切取、制作并比較兩組已植入人工骨瘤結節(jié)的脫鈣H-E染色組

12、織切片以了解CcHA體內對腫瘤的抑制情況。結果示：骨巨細胞瘤模型中兩處瘤結節(jié)植入CCHA后，瘤結節(jié)出現明顯縮小并逐漸出現包括局部小塊皮膚在內的干性壞死，對照組植入CHA后瘤結節(jié)無明顯變化。肺癌腫瘤模型在裸鼠接種瘤細胞后4-7天于頸背部或前臂腋窩處及后背部出現腫塊，并迅速膨大。成瘤后10天行人工骨植入前腫瘤結節(jié)平均體積為735.67±116.11mm<'3>。人工骨植入后可見對照CHA組裸鼠腫瘤呈現惡性持續(xù)增長。實驗組CCt{A植入后腫瘤

13、出現明顯生長抑制，腫瘤體積減小，部分瘤結節(jié)及局部皮肢出現干性壞死，瘤結節(jié)取材時平均體積為132.13±51.10mm<'3>，與對照CHA植入組(取材時平均體積為4564.33±320.03mm<'3>)相比有顯著性差異(P=0.001)。 小結：CCHA在體內對多系骨相關腫瘤細胞具有良好的抑制作用。 四、復合人工骨體內成骨實驗 由于所有化療藥物對機體的作用存有兩面性，CCHA所復合的藥物量較大，植入體內后局部藥

14、物濃度較高，對可能殘留的腫瘤細胞有殺傷作用的同時對正常的周圍組織也存在一定的殺傷作用，其植入骨缺損后可能影響骨誘導、骨傳導及骨生長的作用，從而無法與周圍骨缺損形成骨愈合。為了進一步研究自制CHA在體內的降解和新骨替代行為以及CCHA植入體內后能否起到骨支架、骨傳導及骨生長的作用，與骨缺損之間形成骨愈合，為將來CCHA的進一步改進及用于修復骨缺損的研究及臨床應用提供理論依據。實驗組及對照組，經手術分別將CCHA及CHA人工骨植入兔股骨兩干

15、骺端的骨缺損模型中，術后定期行大體觀察、兩股骨X線片及取材行組織切片，觀察材料降解和被新骨替代的速度、骨與材料界面的結合情況，材料內部新骨生長情況。結果示：術后動物一般情況良好，傷口愈合良好，無不良并發(fā)癥；CHA植入后比CCHA較快與周圍骨形成組織及骨橋連接，植入4周后X線片影像示CHA邊緣開始逐漸不清，組織切片顯示周圍早期有疏松結締組織長入材料孔隙內，緊貼材料孔壁富含成骨細胞且逐漸有類骨質及骨細胞形成，材料周邊及中央區(qū)多處出現新骨質生

16、長并逐漸連接融合替代材料形成骨小梁，且與動物骨形成骨愈合。CCHA植入后早期約8周內局部以抑制組織細胞生長為主，6周至12周逐漸有組織結構向材料孔隙內生長且逐漸出現成骨細胞、骨基質及骨細胞，新生骨逐漸生長替代融合，于26周左右與周圍骨形成骨愈合，28周左右材料周邊及中央區(qū)的成骨情況基本跟對照組CHA植入一致，說明CCHA植入早期雖對骨愈合有一定的抑制作用，但最終仍可自行與周圍骨缺損達到骨愈合。 小結：CCHA在體內與CHA一樣具