奶牛持續(xù)性感染口蹄疫病毒的分子生物學(xué)檢測(cè).pdf

1、　　本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用分子生物學(xué)原理，建立一種RT-PCR方法，用于奶牛持續(xù)性感染FMDV的檢測(cè)，并對(duì)毒株的主要結(jié)構(gòu)蛋白基因進(jìn)行序列分析，這是我國(guó)首次在分子水平上對(duì)奶牛持續(xù)性感染FMDV問題進(jìn)行研究，為國(guó)內(nèi)FMDV的檢測(cè)及分子流行病學(xué)調(diào)查打下了基礎(chǔ)?！　「鶕?jù)已發(fā)表的口蹄疫病毒(FMDV)基因序列，自行設(shè)計(jì)了一對(duì)引物，擴(kuò)增口蹄疫病毒3D后1/3區(qū)段，應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)技術(shù)，從細(xì)胞毒中擴(kuò)增出大小為489bp的基因片段。經(jīng)克隆

2、及DNA序列分析表明所擴(kuò)增片段為FMDV基因。該方法在靈敏度方面，可檢測(cè)出0.01個(gè)TCID50的病毒含量，同時(shí)該方法還有較好的特異性，不與豬的其它疾病如PRV、PRRSV、JEV等發(fā)生交叉反應(yīng)。陽性樣品的檢測(cè)結(jié)果與反向間接血凝(IHA)檢測(cè)結(jié)果的符合率為100％，證明該方法靈敏、特異、簡(jiǎn)單可靠?！　?yīng)用所建立的RT-PCR方法，對(duì)采自3個(gè)奶牛場(chǎng)的55份鮮奶樣品及40份牛鼻試子樣品進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果在部分鮮奶樣品及鼻試子樣品中可擴(kuò)增到長(zhǎng)度

3、約為489bp大小的條帶?？寺『螅?jīng)酶切鑒定及DNA序列分析，表明擴(kuò)增片段為FMDV，與病豬水泡皮分離毒株的同源性高達(dá)90.2％。此結(jié)果表明，所建立的RT-PCR方法可用于奶牛隱性感染FMDV的檢測(cè)?！　〗Y(jié)構(gòu)蛋白VP1是誘導(dǎo)中和抗體的主要成份，在分子流行病學(xué)調(diào)查中，趨向于分析VP1基因的核苷酸序列差異作為建立遺傳變異系譜樹。另設(shè)計(jì)一對(duì)引物，擴(kuò)增FMDV主要結(jié)構(gòu)蛋白基因VP1。擴(kuò)增片段長(zhǎng)838bp，含完整的VP1基因。應(yīng)用這對(duì)引物擴(kuò)增R