檢測(cè)口蹄疫病毒單抗ELISA方法的建立及口蹄疫病毒多抗原基因的融合表達(dá).pdf

1、口蹄疫(foot-and-mouthdisease，F(xiàn)MD)是由口蹄疫病毒(foot-and-mouthdiseasevirus，F(xiàn)MDV)引起的偶蹄動(dòng)物共患的急性接觸性傳染病，人也可以感染。本病有極強(qiáng)的傳染性，可形成大范圍流行，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失和政治影響。預(yù)防和控制該病的關(guān)鍵是高效疫苗和準(zhǔn)確的診斷方法的應(yīng)用。目前用于口蹄疫的診斷技術(shù)種類(lèi)很多，而傳統(tǒng)ELISA大多用于檢測(cè)抗體，其抗原需要完整的病毒，生產(chǎn)過(guò)程需要昂貴的培養(yǎng)基，成本高，且

2、存在散毒的危險(xiǎn)。檢測(cè)病毒是確診病毒感染的標(biāo)準(zhǔn)，單抗具有特異性高的特點(diǎn)，因此基于單抗而建立的診斷方法具有重要的應(yīng)用前景。此外，有研究表明，將口蹄疫具有免疫原性的結(jié)構(gòu)蛋白基因和裂解酶基因(3C基因)連接起來(lái)構(gòu)建的多抗原基因表達(dá)載體，表達(dá)后與單一的免疫原性基因相比，具有較高的免疫原性。本研究開(kāi)展了抗口蹄疫病毒單克隆抗體的制備及初步應(yīng)用研究和口蹄疫病毒免疫原蛋白在大腸桿菌的融合表達(dá)。 1抗O型口蹄疫病毒單克隆抗體的制各和初步應(yīng)用以純化的

3、O型FMDV為免疫原，免疫BALB/C小鼠，將脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0融合，用ELISA篩選獲得2株分泌抗O型FMDV單克隆抗體(McAb)的雜交瘤細(xì)胞，分別命名為2G12和2G8。染色體數(shù)目分析證明為雜交產(chǎn)物，免疫熒光試驗(yàn)證明兩株單抗均能特異性地與FMDV反應(yīng)。選擇其中效價(jià)較高的1株(2G12)用于下列實(shí)驗(yàn)。以自行制備的兔抗FMDV高免血清IgG為捕獲抗體，包被酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)微量反應(yīng)板，以單抗2G12為檢測(cè)抗體，建立了快速檢測(cè)F

4、MDV抗原的雙抗體夾心ELISA。該方法能檢出90ng/100μLFMDV病毒，與豬瘟病毒(HCV)、豬呼吸與繁殖障礙綜合癥耳病病毒(PRRSV)、偽狂犬病毒(PrV)、豬細(xì)小病毒(PPV)和乙腦病毒(JEV)均不起反應(yīng)。本研究為檢測(cè)口蹄疫病毒抗原提供了靈敏和特異的方法。 2口蹄疫病毒多抗原基因(VP1-VP3-3C)在大腸桿菌中的融合表達(dá)應(yīng)用PCR擴(kuò)增技術(shù)獲得1564bp的片段，包含口蹄疫病毒VP1全長(zhǎng)基因、VP3部分基因和編

5、碼3C裂解酶的全長(zhǎng)基因，連接到pMD-18T載體上，在獲得重組質(zhì)粒pMD-18T-VP1-VP3-3C后，進(jìn)行序列分析；將此片段連接到Pgex-KG載體，構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pKG-VP1-VP3-3C，將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，收集菌體進(jìn)行SDS-PAGE電泳，結(jié)果表明，VP1-VP3-3C基因在大腸桿菌中獲得成功表達(dá)，其表達(dá)產(chǎn)物為分子量83KDa的融合蛋白，并且能與豬抗FMDV血清發(fā)生特異性反