豬圓環(huán)病毒四川株分離鑒定及豬圓環(huán)病毒2型ORF2的克隆與序列分析.pdf

1、該研究參照GenBank中豬圓環(huán)病毒(Porcine Circovirus,PCV)基因序列,設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物,建立了PCV的PCR-RFLP鑒別診斷方法.利用該方法從四川部分豬場(chǎng)采集的斷乳豬多系統(tǒng)衰弱綜合征(PMWS)的病料11個(gè)、豬皮炎-腎炎綜合癥(PDNS)病料1個(gè)中檢測(cè)到陽(yáng)性病料7個(gè),檢測(cè)陽(yáng)性率為58.3﹪,說明該病在四川普遍存在,并通過NcoI酶切該片段成功鑒別出1個(gè)PCV-1和2個(gè)PCV-2陽(yáng)性病料,并依次命名為PCV-1

2、 SCHC株、PCV-2 SCH A和PCV-2 SCH B株;并用此方法對(duì)豬源細(xì)胞進(jìn)行PCV檢測(cè),在IBRS-2細(xì)胞中鑒別診斷出PCV-1,并命名為SCH D株.對(duì)2個(gè)PCV-2檢測(cè)陽(yáng)性病料,利用無(wú)PCV的PK-15細(xì)胞進(jìn)行增殖培養(yǎng),經(jīng)電鏡檢測(cè),表明只有PCV-2 SCHA株增殖成功.參照GenBank中豬圓環(huán)病毒2型(PCV-2)的基因序列,設(shè)計(jì)一對(duì)PCV-2的ORF2特異性引物,從該室分離的PCV-2 SCHA株感染PK-15細(xì)胞

3、中擴(kuò)增出ORF2的基因(702bp).將此片段克隆在PMD18-T載體中,篩選獲得重組質(zhì)粒PDM18-ORF2,并對(duì)插入片段進(jìn)行測(cè)序分析,表明PCV-2的ORF2的克隆成功.PCV-2的ORF2的克隆成功,為進(jìn)一步的基因表達(dá)、診斷和重組疫苗以及PCV-1和PCV-2基因改造奠定了基礎(chǔ).通過多序列比對(duì)和遺傳進(jìn)化樹分析,證實(shí)了PCV-2 SCHA株ORF2基因的變異范圍.通過比對(duì)證實(shí)SCH A株的ORF2與中國(guó)HuNan株ORF2的同源性最

4、高,可達(dá)到96﹪的核苷酸同源性,96﹪的氨基酸的同源性,進(jìn)一步證實(shí)該序列為PCV-2 ORF2的基因.遺傳進(jìn)化樹分析證實(shí)了PCV ORF2有兩個(gè)不同的基因型存在:沒有致病性的PCV-1 ORF2基因型和有致病性的PCV-2 ORF2基因型;在PCV-2 ORF2分支中,中國(guó)分離株之間ORF2變異較大,中國(guó)分離株的ORF2的親緣關(guān)系較復(fù)雜.該文研究的數(shù)據(jù)說明盡管PCV-2 ORF2不同分離株之間基因型較穩(wěn)定,但是不同的地域株之間有較大地變