豬2型圓環(huán)病毒河南株ORF2基因的克隆、序列分析及其真核表達(dá).pdf

1、豬2型圓環(huán)病毒（Porcinecircovirustype2，PCV-2）是引起豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征、圓環(huán)病毒相關(guān)疾?。≒orcinecircovirus-associateddisease，PCVAD）等相關(guān)疾病的重要病原。PCV-2的ORF2基因不僅是其主要結(jié)構(gòu)蛋白的編碼基因，而且也是區(qū)分PCV-1和PCV-2的重要區(qū)域，其編碼蛋白具有良好的抗原性。本研究利用PCR技術(shù)擴(kuò)增出PCV-2PDSH株和LY株ORF2基因，并進(jìn)行了分子

2、克隆，成功地實(shí)現(xiàn)了PDSH株ORF2基因在BHK-21細(xì)胞中的表達(dá)，并對(duì)表達(dá)的重組蛋白進(jìn)行了初步鑒定。 參照GenBank發(fā)表的PCV-2基因序列，設(shè)計(jì)合成一對(duì)引物，對(duì)PCV-2PDSH株、LY株ORF2基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，呈現(xiàn)一條約719bp的特異條帶，將其回收后克隆到pMD18-Teasy載體進(jìn)行測(cè)序，將所測(cè)序列與已公布的PCV-2ORF2序列進(jìn)行同源性比較，并繪制系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。通過(guò)擴(kuò)增可以獲得7

3、02bp的PCV-2ORF2全基因，編碼233個(gè)氨基酸，分子量為27995.93D。 PCV-2河南分離株ORF2之間的核苷酸同源性為97.0-99.0％，氨基酸同源性為95.3-99.1％，其中LY株與GenBank中的xx株之間的核苷酸和氨基酸同源性最高，核苷酸同源性達(dá)98.9％，氨基酸同源性達(dá)99.1％：和國(guó)內(nèi)毒株相比，PDSH株與GenBank中的HZ株、LY株與GenBank中的HANGZHOU株同源性最高達(dá)99.3％

4、；和國(guó)外毒株相比，LY株與國(guó)外的Denmark株的核苷酸同源性最高達(dá)99.6％，PDSH株與國(guó)外的Brazil株、Denmark株同源性最高達(dá)99.3％；LY株與Denmark株氨基酸同源性最高達(dá)99.6％，PDSH株與國(guó)外的Brazil株氨基酸同源性最高達(dá)，JZ株與PDSH株之間的同源性最低。 根據(jù)基因分析，設(shè)計(jì)一對(duì)帶有酶切位點(diǎn)的引物，利用此引物從克隆的pMD18-T-ORF2重組質(zhì)粒擴(kuò)增出含ORF2主要抗原位點(diǎn)的566bp區(qū)

5、段，經(jīng)BamHⅠ和HndⅢ雙酶切，將回收的ORF2基因定向插入真核表達(dá)載體pcDNA3.0，經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ酶切、測(cè)序鑒定，得到陽(yáng)性重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.0-ORF2。將重組質(zhì)粒pcDNA3.0-ORF2瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到BHK-21細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞經(jīng)RT-PCR檢測(cè)到了PCV-2ORF2基因的mRNA；經(jīng)間接免疫熒光檢測(cè)表明，表達(dá)的重組蛋白能夠被PCV-2陽(yáng)性血清所識(shí)別，具有良好的抗原性。 結(jié)果表明：成功構(gòu)建了克隆質(zhì)粒

6、pMD18-T-ORF2及其表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.0-ORF2；pcDNA3.0/ORF2質(zhì)粒在BHK-21細(xì)胞中進(jìn)行了瞬時(shí)表達(dá)，在轉(zhuǎn)染的BHK-21細(xì)胞中檢測(cè)到PCV-2ORF2基因的mRNA，表達(dá)的Cap蛋白可與PCV-2抗血清發(fā)生特異性反應(yīng)。 本研究成功構(gòu)建了克隆質(zhì)粒pMD18-T-ORF2及其真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.0-ORF2；重組表達(dá)質(zhì)粒在BHK-21細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)了具有Cap蛋白生物學(xué)活性的蛋白。本研究為PCV-