茶樹自交不親和類型的鑒定及相關(guān)基因克隆與表達(dá)分析.pdf

1、茶樹(Camellia sinensis(L.)O.Kuntze）屬山茶科山茶屬，為多年生異花授粉植物。茶樹具有高度雜合性，而且生殖周期較長，遺傳學(xué)中的純系自交、雜交等方法應(yīng)用相當(dāng)少，這也使得茶樹的遺傳學(xué)研究遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于其它經(jīng)濟(jì)作物，從而使茶樹的遺傳學(xué)規(guī)律的研究受到阻礙。茶樹結(jié)實(shí)率低，自花授粉基本不育，表現(xiàn)出自交不親和性。因此，茶樹的自交不親和研究是茶樹遺傳育種中一個重要的基礎(chǔ)課題。
　　 本研究以茶樹為研究材料，從茶樹花粉的體外

2、保存與萌發(fā)條件、茶樹花粉管在自交和雜交后在花柱及在子房內(nèi)的生長與受阻情況、茶樹自交后與雜交后cDNA-AFLP差異分析、茶樹持家基因3-磷酸甘油醛脫氫酶克隆與熒光實(shí)時定量方法的建立，與茶樹自交不親和相關(guān)的茶樹鈣依賴型蛋白激酶基因(CsiCDPK)的克隆與表達(dá)鑒定等幾個方面對茶樹的自交不親和機(jī)理類型與相關(guān)基因進(jìn)行了研究，主要結(jié)果如下:
　　 1、選取H3BO4、Ca(NO3)2、PEG-4000、蔗糖、葡萄糖、麥芽糖、山梨醇等碳源

3、和不同pH值作為參考因子對茶樹花粉的萌發(fā)進(jìn)行研究，結(jié)果表明茶樹花粉萌發(fā)和花粉管生長的最適液體培養(yǎng)基是:0.01％硼酸，0.05％ Ca(NO3)2，5％ PEG-4000，5％麥芽糖，pH值在5.0～6.0之間(緩沖液30 mmol·L-1 MES)。在此條件下的茶樹花粉萌發(fā)率為82.24％，花粉管生長長度為492μm?；ǚ郾４嬗?℃5d內(nèi)發(fā)芽率仍有59.67％，適合短期保存，使用液N2冷凍后-70℃保存180d后萌發(fā)率仍有60.24％

4、,適合長期保存。
　　 2、選取‘祁門種’、‘龍井長葉’、‘福鼎大白茶’及‘藪北’等茶樹品種間進(jìn)行自交和雜交，授粉后不同時間對花柱組織及子房進(jìn)行采樣，通過苯胺藍(lán)熒光染色觀察花柱，對茶樹子房的進(jìn)行石蠟切片觀察。結(jié)果顯示，雜交與自交的花粉在授粉48h大多數(shù)花粉管均穿過花柱進(jìn)入子房組織;但雜交的茶樹花粉管能順利進(jìn)入子房，自交的花粉管則不能進(jìn)入，僅停留在子房腔內(nèi)。說明茶樹的自交不親和可能與原先設(shè)想的配子體自交不親和機(jī)理不同，可能屬于延遲

5、型自交不親和(LSI)或子房自交不親和(OSI)。
　　 3、以未授粉茶樹雌蕊為對照，比較異交授粉后與自交授粉后cDNA-AFLP差異表達(dá)，通過比較選擇差異條帶進(jìn)行序列測定，并與Genbank中已知數(shù)據(jù)對比，對其中功能基因進(jìn)行分析，初步統(tǒng)計(jì)評價(jià)，找出已知并可能與自交不親和相關(guān)的基因序列15條，其中與自交授粉相關(guān)或信號傳導(dǎo)相關(guān)較為密切的有鈣依賴型蛋白激酶，衰老相關(guān)蛋白，G蛋白和細(xì)胞周期蛋白等。
　　 4、參照擬南芥、龍眼和

6、豌豆的GAPDH保守區(qū)設(shè)計(jì)GAPDH上游與下游引物，經(jīng)克隆，轉(zhuǎn)化，測序，比對，該片段的氨基酸序列與擬南芥、龍眼、豌豆的核苷酸序列的同源性分別為80％、83％、81％，利用3'和5'-RACE克隆了該基因全長，3-磷酸甘油醛脫氫酶基因在多種植物中表達(dá)穩(wěn)定，可以作為實(shí)時熒光定量PCR的內(nèi)標(biāo)基因使用。
　　 5、利用茶樹GAPDH為內(nèi)標(biāo)基因?qū)DNA-AFLP差異表達(dá)后的7個片段進(jìn)行差異表達(dá)檢測，發(fā)現(xiàn)這7個片段均能在自交24h后在子房

7、中特異表達(dá)。從中挑選1個片段研究對象，從獲得的差異圖譜中，克隆得到一個與茶樹自交不親和相關(guān)的鈣依賴蛋白激酶基因片段，然后用RCAE方法擴(kuò)增獲得其cDNA全長序列，將其命名為茶樹CsiCDPK(Camellia sinensis calcium-dependent protein kinase)基因。該基因cDNA序列全長2281bp，編碼760個氨基酸。用熒光實(shí)時定量PCR方法進(jìn)一步研究該基因的功能，檢測其表達(dá)特異性，結(jié)果表明，該基因在