蕓苔屬蔬菜小孢子培養(yǎng)及自交不親和性的分子鑒定.pdf

1、蕓苔屬蔬菜是一類(lèi)重要的蔬菜作物，在我國(guó)種質(zhì)資源豐富，大多數(shù)蕓苔屬蔬菜屬異花授粉作物，雜種優(yōu)勢(shì)明顯。使用常規(guī)方法，選育一個(gè)純合的自交系或自交不親和系一般需要5-8年時(shí)間。而運(yùn)用小孢子培養(yǎng)技術(shù)在1-2年就可以獲得大量純合的雙單倍體植株。目前，大部分蕓苔屬蔬菜均是利用自交不親和系來(lái)生產(chǎn)F<,1>代雜交種。自交不親和性廣泛存在，但自交不親和性強(qiáng)度及S單元型類(lèi)型鑒定相當(dāng)繁瑣。本研究的目的主要是想結(jié)合小孢子培養(yǎng)與自交不親和性的分子鑒定，建立一套快速

2、而高效的育種體系。本研究選取大白菜、紅菜苔和甘藍(lán)3種蕓苔屬蔬菜，研究了影響小孢子培養(yǎng)和植株再生過(guò)程中的諸多因素，獲得了大量胚狀體和再生植株。并對(duì)其后代植株的倍性，遺傳多樣性，自交不親和性的強(qiáng)度、分子遺傳及表達(dá)進(jìn)行了分析。最后，調(diào)查了目前我國(guó)主要的幾種蕓苔屬蔬菜中自交不親和S單元型的類(lèi)型。主要結(jié)果如下： 1．小孢子培養(yǎng)因素研究 對(duì)小孢子培養(yǎng)過(guò)程中基因型、小孢子發(fā)育時(shí)期、活性炭、小孢子密度、蔗糖濃度、高溫預(yù)處理和大量元素濃度

3、等7種因素進(jìn)行了研究。在73.3％的大白菜，76.9％的紅菜苔，50％的甘藍(lán)基因型中獲得了小孢子胚狀體。選擇單核靠邊期比率為50-70％的小孢子，將密度設(shè)為1.5-2個(gè)花蕾/ml，添加0.3mg/ml活性炭有利于大白菜和紅菜苔小孢子胚胎發(fā)生。而選擇含10-30％的雙核期小孢子，將密度設(shè)為1.5個(gè)花蕾/皿，添加0.1mg/ml有利于甘藍(lán)小孢子胚胎發(fā)生。蔗糖濃度為13％時(shí)，在3種蕓苔屬蔬菜中均獲得了較好的結(jié)果。另外，在32℃熱激處理18h，

4、將大量元素的濃度減少一半有利于大多數(shù)紅菜苔基因型的小孢子胚胎發(fā)生。 2．植株再生因素研究 對(duì)胚狀體再生過(guò)程中瓊脂濃度，胚齡，低溫預(yù)處理和培養(yǎng)基類(lèi)型等4種因素進(jìn)行了研究。在10個(gè)大白菜，9個(gè)紅菜苔和2個(gè)甘藍(lán)基因型中獲得了大量再生植株。結(jié)果表明，瓊脂濃度為1.2％，在4℃下處理10d，均能顯著促進(jìn)3種蔬菜的植株再生；大白菜和紅菜苔最適胚齡為20-29d，而甘藍(lán)為30d以上；B5和MS兩種培養(yǎng)基對(duì)植株的再生沒(méi)有明顯的影響。

5、 3.DH植株倍性鑒定 對(duì)3種蕓苔屬蔬菜獲得的小孢子植株的倍性鑒定后，發(fā)現(xiàn)大白菜自然加倍率不同品種間變化較大，但都在50％以上，紅菜苔的自然加倍率相當(dāng)高，達(dá)到70％以上，而甘藍(lán)的自然加倍率較低，在30％左右。 4.DH群體內(nèi)自交不親和性的分子鑒定與遺傳 利用class I和class II的SLC和SRK特異引物，對(duì)3種蕓苔屬蔬菜7個(gè)DH群體的各株系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同時(shí)通過(guò)花期自交鑒定了自交不親和性的強(qiáng)度。結(jié)

6、果表明，具class I等位基因的株系絕大部分是強(qiáng)自交不親和系，而具class II等位基因的株系大多為弱自交不親和系。class I和class II在DH群體中的遺傳規(guī)律表明，兩種不同類(lèi)型的class I復(fù)等位基因在DH群體的分離比率符合1：1；而含有class I和classII的基因型，存在嚴(yán)重的分離偏袒現(xiàn)象。 5.自交不親和基因在DH系的表達(dá)分析 在開(kāi)花期分別提取3種蕓苔屬蔬菜DH株系不同時(shí)期的花蕾與不同組織的

7、RNA，通過(guò)Northern Blot分析了自交不親和基因在植株中組織和時(shí)『自J特異性表達(dá)情況，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)class I基因的表達(dá)在三種蕓苔屬蔬菜中比較一致，但classII在紅菜苔的表達(dá)要晚些。 6.大白菜DH群體的遺傳變異分析 利用6個(gè)農(nóng)藝學(xué)性狀、5個(gè)品質(zhì)性狀和RAPD標(biāo)記，首次對(duì)兩個(gè)大白菜雙單倍體(DH)群體內(nèi)的遺傳變異進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，大白菜DH群體中農(nóng)藝性狀，品質(zhì)性狀和RAPD標(biāo)記均存在豐富的遺傳多樣性，具有

8、很大的選擇潛力。其中，兩個(gè)DH群體的農(nóng)藝性狀和品質(zhì)性狀的遺傳變異系數(shù)比較一致，但品質(zhì)性狀的平均變異系數(shù)高于農(nóng)藝性狀的。利用RAPD標(biāo)記計(jì)算出的多態(tài)性位點(diǎn)百分率和基因多樣性指標(biāo)豐抗70比華陽(yáng)3號(hào)大。農(nóng)藝性狀，品質(zhì)性狀和RAPD標(biāo)記之間對(duì)DH群體遺傳多樣性評(píng)價(jià)存在一定的相關(guān)性，但是整體上相關(guān)性不高。 7.大白菜雜交組合選配 利用選育的自交不親和系在大白菜中配置了37個(gè)雜交組合，進(jìn)行了品種比較實(shí)驗(yàn)，所試組合均表現(xiàn)出整齊一致的

9、特點(diǎn)，其中有些組合表現(xiàn)出早熟、豐產(chǎn)、抗病等特點(diǎn)，具有較好的應(yīng)用潛力。 8.蕓苔屬蔬菜S單元型的鑒定與分布 運(yùn)用PCR-RFLP的方法對(duì)5種蕓苔屬蔬菜72個(gè)基因型的自交不親和基因SLG和SRK的擴(kuò)增效率和鑒定的多樣性，以及S單元型的類(lèi)型進(jìn)行了研究。Class ISRK的擴(kuò)增和鑒定效率普遍要比SLG強(qiáng)。其中在66個(gè)基因型中檢測(cè)到了Class I等位基因，它們?cè)诖蟀撞?，紅菜苔，花椰菜和甘藍(lán)依次分成16，10，7和10種類(lèi)型。C

10、lassII SLG和SRK的擴(kuò)增和鑒定效率比較一致，有55個(gè)基因型含有Class II等位基因，除芥菜只有1類(lèi)外，在其他作物中均分為3類(lèi)。此外，克隆了11個(gè)Class I和10個(gè)Class II等位基因。通過(guò)PCR-RFLP分析表現(xiàn)一致的S單元型展現(xiàn)出高度的序列一致性。這說(shuō)明PCR-RFLP是有效的，并且SRK應(yīng)該是一個(gè)更好的鑒定S單元型的標(biāo)記。S單元型在一些物種中呈現(xiàn)明顯的區(qū)域分布特點(diǎn)，因此應(yīng)該加強(qiáng)種質(zhì)資源的交流和合作，以豐富當(dāng)?shù)赜?/p>