甘藍(lán)自交不親和性信號(hào)傳導(dǎo)元件MLPK與SSP編碼基因的FISH定位研究.pdf

1、甘藍(lán)等蕓薹屬植物的自交不親和性在遺傳上受一個(gè)帶有復(fù)等位基因的多態(tài)性S位點(diǎn)(S—locus)控制，并且存在著一個(gè)以S位點(diǎn)基因介導(dǎo)的自交不親和信號(hào)傳導(dǎo)途徑。但是，關(guān)于這條信號(hào)傳導(dǎo)途徑相關(guān)元件編碼基因之間的連鎖關(guān)系、以及它們與S位點(diǎn)的連鎖關(guān)系和在甘藍(lán)染色體上的具體位置分布至今未見(jiàn)報(bào)道。另外，甘藍(lán)是蕓薹屬的三個(gè)基本種之一，在蕓薹屬的自然和人工合成過(guò)程中，甘藍(lán)的染色體組參與的染色體配對(duì)行為十分普遍，染色體之間的重排率很高，極大地影響著甘藍(lán)自交不親

2、和基因在蕓薹屬間的轉(zhuǎn)移和遺傳變異。因此，對(duì)自交不親和基因進(jìn)行染色體定位和DNA纖維定位，對(duì)蕓薹屬物種自交不親和性的研究和利用具有十分重要的意義。 本研究采用熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)技術(shù)，以MLPK和SSP基因片段為探針，分別在甘藍(lán)有絲分裂前中期染色體、減數(shù)分裂早粗線(xiàn)期染色體以及伸長(zhǎng)DNA纖維(extended DNA fibers，EDFs)等3種分辨率水平的

3、靶DNA載體上進(jìn)行全面的物理定位研究。旨在為孢子體型自交不親和性機(jī)理和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的明確以及自交不親和性基因的遺傳變異的研究提供全新內(nèi)容，并為下一步甘藍(lán)高分辨率物理圖譜的構(gòu)建和細(xì)胞遺傳圖譜的整合打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。 主要研究結(jié)果如下： 1．通過(guò)對(duì)相關(guān)程序的探索優(yōu)化，建立了適合于甘藍(lán)的FISH靶DNA載體制備技術(shù)流程，利用該技術(shù)體系成功制備出甘藍(lán)有絲分裂前中期染色體、減數(shù)分裂早粗線(xiàn)期染色體以及伸長(zhǎng)DNA纖維等3種層次的靶DNA

4、載體。 (1)本研究采用變溫處理同步化誘導(dǎo)方法，使甘藍(lán)有絲分裂前中期染色體分裂相比率達(dá)到80％以上，顯著的提高了前中期染色體制片的分裂相數(shù)目。 (2)甘藍(lán)根尖在20℃條件下，采用0.002mol/L8—羥基喹啉預(yù)處理1h，效果最佳。 (3)采用2％纖維素酶和2％果膠酶混合液37℃酶解約2h、0.075mol/L的KC1在25℃低滲30min的解離條件，制備的甘藍(lán)前中期染色體效果最佳；采用2％纖維素酶和2％果膠酶混

5、合酶液37℃解離約3h的方法，可獲得伸展良好、背景干凈的粗線(xiàn)期染色體。 (4)采用改進(jìn)的細(xì)胞核提取方法，制備出了分布較均勻、密度合適的細(xì)胞核；STE細(xì)胞核裂解液作用時(shí)間須控制在5～8min；采用分子梳理法成功制備出伸展程度較均勻，大多呈平行狀態(tài)的DNA纖維。 2．通過(guò)對(duì)相關(guān)相關(guān)技術(shù)參數(shù)的探索，建立了適用于3種伸長(zhǎng)度染色體的HSH技術(shù)體系。在前中期和早粗線(xiàn)期染色體上采用的FISH程序基本一致，而EDFs—FISH中，制片無(wú)

6、需進(jìn)行前處理和預(yù)變性，雜交液中探針濃度以及雜交后洗脫溫度略有不同，其余程序在3種載體上可保持一致。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，均取得較好的雜交效果，證明該方法的可行性。 (1)染色體雜交前處理是否充分直接影響到原位雜交的信號(hào)檢出率和信噪比的高低。 (2)前中期及早粗線(xiàn)期染色體在70％去離子甲酰胺中，70℃變性2min，效果最佳；若變性時(shí)間稍長(zhǎng)，對(duì)前中期染色體的影響更為明顯。 (3)FISH的最佳雜交液組成為：50％(v/v)去

7、離子甲酰胺、7.5％(v/v)硫酸葡聚糖、2×SSC、1.5ng/μL探針(EDFs—FISH0.5ng/μL)、0.5％(w/v)SDS、0.5μg/μLssDNA。 (4)針對(duì)單、低拷貝探針的3級(jí)洗脫，37℃獲得的雜交信號(hào)比較穩(wěn)定，信噪比較高。對(duì)于EDFs—FISH，將溫度提高到40℃，能更好地減少非特異信號(hào)，提高信噪比。 (5)利用抗體偶聯(lián)物進(jìn)行信號(hào)的級(jí)聯(lián)放大，對(duì)于雜交信號(hào)檢出率的提高影響顯著。 3．在甘藍(lán)

8、前中期染色體上，MLPK與SSP探針都只在1對(duì)同源染色體上檢測(cè)到綠色雜交信號(hào)。MLPK與5SrDNA探針信號(hào)存在于同一對(duì)染色體上，位于1對(duì)近中著絲粒染色體的短臂中部：SSP探針信號(hào)位于1對(duì)具有隨體的近端著絲粒染色體的長(zhǎng)臂端部。沒(méi)有觀察到同時(shí)出現(xiàn)在姊妹染色單體上的雙點(diǎn)信號(hào)現(xiàn)象。MLPK探針的檢出率為11.8％，SSP探針為9.1％。MLPK和SSP探針在甘藍(lán)減數(shù)分裂早粗線(xiàn)期染色體上，1個(gè)分裂相內(nèi)最多只觀察到2個(gè)同源雜交信號(hào)，探針信號(hào)的檢出

9、率分別為31.4％和20.4％。 4．本研究使用的伸長(zhǎng)DNA纖維的分辨率約為1.5kb。在每條DNA纖維上，1.7kb的MLPK和1.2kb的SSP探針都呈現(xiàn)單個(gè)的綠色雜交信號(hào)點(diǎn)，推斷MLPK與SSP在1條DNA纖維(染色體)上可能只有1個(gè)拷貝。綜合分析MLPK與SSP在3種分辨率水平的靶DNA載體上的FISH結(jié)果判斷，在甘藍(lán)染色體組中MLPK與SSP基因可能都只有1個(gè)同源序列座位，初步證明二者在甘藍(lán)單倍體基因組中的單拷貝性。