施氏假單胞菌JP1厭氣降解多環(huán)芳烴機(jī)制的研究.pdf

1、多環(huán)芳烴（PAHs）是持久性有機(jī)污染物（POPs）中的一種，對生物體具有致癌、致突變、致畸等嚴(yán)重危害。人類活動和能源利用過程中產(chǎn)生的多環(huán)芳烴通過污水排放、地面徑流、大氣沉降等途徑進(jìn)入海洋，最終的歸宿是海底沉積物，海底環(huán)境缺氧又極大的限制了其降解。課題組前期從汕頭海域海底表層沉積物分離得到的兼性厭氧菌施氏假單胞菌 JP1(Pseudomonas stutzeri JP1)，能夠在有氧和厭氧條件下降解多種多環(huán)芳烴。本文以菌株 JP1為研究對

2、象，研究添加碳源、氮源、電子受體以及不同鹽度和時間對菌株厭氧降解苯并(a)芘的影響，通過GC-MS檢測菌株降解PAHs的產(chǎn)物，通過基因組測序、轉(zhuǎn)錄學(xué)驗(yàn)證功能，分析其厭氧降解苯并(a)芘的差異蛋白，探索菌株 JP1厭氧降解苯并(a)芘等高分子量多環(huán)芳烴的機(jī)制，為闡明其微生物厭氧降解機(jī)制奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
　　研究結(jié)果表明：菌株 JP1能夠在厭氧環(huán)境中降解苯并(a)芘等多環(huán)芳烴。隨著時間的增加菌株對苯并(a)芘的厭氧降解率逐漸增加；在

3、鹽度20‰時厭氧降解率最高；二糖能促進(jìn)菌株對苯并(a)芘的厭氧降解，而單糖則抑制降解；除了L-天冬酰胺之外，其他幾種氨基酸都能促進(jìn)菌株厭氧降解苯并(a)芘；菌株 JP1對菲的厭氧降解率高于對蒽的降解率，對芘、?、苯并蒽的厭氧降解率則無明顯差異；添加亞硫酸鈉、氧化鐵、氯酸鉀對菌株 JP1厭氧降解苯并(a)芘有明顯促進(jìn)作用，硫代硫酸鈉、高氯酸鉀、碳酸氫鈉對菌株 JP1厭氧降解苯并(a)芘反而有抑制作用。
　　菌株 Pseudomona

4、s stutzeri JP1在厭氧環(huán)境中能夠?qū)⒈讲?a)芘降解為1,2-二甲基苯并蒽、7,8,9,10-四氫苯并(a)芘、5-乙基?三者中的一種或多種，?或/和苯并蒽，另外還產(chǎn)生大量的支鏈烴類。菌株 JP1厭氧降解芘生成4,5-二甲基菲，4-甲基菲，菲。菌株JP1厭氧代謝苯并蒽的產(chǎn)物有2,3-二甲基菲，2-甲基菲，以及2-甲基蒽/1-甲基蒽中的一種或兩種。菌株 JP1厭氧降解?的產(chǎn)物有α-甲基二苯乙烯，1-乙基-2-甲基菲，2-甲基菲，

5、1-甲基菲。菌株 JP1厭氧降解菲生成1,2,3,4-四氫化-4-甲基-4-菲酚或/和α-甲基二苯乙烯。菌株 JP1厭氧代謝蒽生成9,10-蒽醌或/和1-蒽醌羧酸。菌株JP1在有氧環(huán)境中能夠?qū)⒈讲?a)芘降解為1,2-二甲基苯并蒽、7,8,9,10-四氫苯并(a)芘、5-乙基?三者中的一種或多種，以及1,6-二乙基-4異丙基萘，另外也產(chǎn)生大量的支鏈烴類。
　　全基因組測序結(jié)果表明：菌株 JP1基因組全長3.59 Mb，含有4533

6、個基因。其中的一些基因組成了幾個基因簇，包括：一個有氧降解芳烴的基因簇，兩個厭氧降解芳烴的基因簇，三個硝酸鹽還原相關(guān)基因的基因簇，并對基因簇中的一些代表性基因通過實(shí)時熒光定量 PCR進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄表達(dá)功能驗(yàn)證，其中一些基因參與厭氧降解苯并(a)芘。在菌株JP1中已發(fā)現(xiàn)有43個芳烴厭氧降解中心途徑苯甲酰CoA連接酶途徑的基因，另外還有一些降解其他芳烴途徑的基因。
　　菌株 JP1不含質(zhì)粒，因此推測其全部基因位于染色體中。對菌株厭氧降解苯

7、并(a)芘的差異蛋白質(zhì)譜分析，得到一個參與外來污染物生物降解和代謝以及糖酵解/糖異生的醇脫氫酶(6-羥基環(huán)己-1-烯-1-羰基酰-CoA脫氫酶)，對其進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR分析進(jìn)一步證實(shí)了其參與多環(huán)芳烴的厭氧代謝。
　　對菌株JP1在四種培養(yǎng)條件（LB培養(yǎng)基中有氧培養(yǎng)（ae_LB），LB培養(yǎng)基中厭氧培養(yǎng)(an_LB)，含苯并(a)芘的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中有氧培養(yǎng)（ae_BaP），含苯并(a)芘的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中厭氧培養(yǎng)（an_BaP））下

8、進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析。ae_BaP中，外顯子和基因間隔區(qū)域分別占37.3％和62.7%；ae_LB中，外顯子和基因間隔區(qū)域分別占65.7%和34.3%；an_BaP中，外顯子和基因間隔區(qū)域分別占32.4%和67.6%；an_LB中，外顯子和基因間隔區(qū)域分別占60.0%和40.0%。分別對ae_BaP vs ae_LB；an_BaP vs ae_BaP；an_BaP vs an_LB；an_LB vs ae_LB的差異表達(dá)基因進(jìn)行分析以及GO富