固氮施氏假單胞菌RpoN蛋白調(diào)控硝酸鹽同化的作用機(jī)制.pdf

1、RpoN（σ54）在細(xì)菌的氮源利用、碳源利用、運(yùn)動(dòng)、生物膜形成、物質(zhì)運(yùn)輸?shù)冗^(guò)程中扮演著重要角色。施氏假單胞菌A1501(Pseudomonas stutzeri A1501)是從我國(guó)南方水稻根際土壤分離的一株聯(lián)合固氮菌，本實(shí)驗(yàn)室對(duì)該菌的固氮系統(tǒng)、碳代謝抑制系統(tǒng)、運(yùn)動(dòng)與生物膜形成系統(tǒng)等進(jìn)行了深入研究，發(fā)現(xiàn)RpoN均在不同程度上參與了上述系統(tǒng)中基因的表達(dá)調(diào)控。為全面了解RpoN在該菌中的作用，本研究對(duì)比分析了A1501野生型與rpoN缺失突

2、變株的轉(zhuǎn)錄譜，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究了RpoN參與該菌硝酸鹽與亞硝酸鹽同化過(guò)程的分子機(jī)制。主要研究結(jié)果如下：
　　1. LB培養(yǎng)條件下轉(zhuǎn)錄譜分析表明，與野生型相比rpoN突變株中有563個(gè)基因的表達(dá)差異顯著（Ratio>2），主要集中在菌體運(yùn)動(dòng)、碳代謝、鐵與氨基酸運(yùn)輸、硝酸鹽與亞硝酸鹽同化過(guò)程，其中258個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，305個(gè)基因下調(diào)。硝酸鹽、亞硝酸鹽同化相關(guān)基因下調(diào)明顯，包括調(diào)節(jié)基因nasR、nasST，硝酸鹽、亞硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)系

3、統(tǒng)基因nasA、nasFED，還原酶基因nasBCG以及谷氨酰胺合成酶基因glnA。由此推測(cè)RpoN可能對(duì)A1501菌的硝酸鹽、亞硝酸鹽同化過(guò)程進(jìn)行直接或者間接的調(diào)控。
　　2.比較了野生型與rpoN突變株以硝酸鹽和亞硝酸鹽為唯一氮源的生長(zhǎng)能力，結(jié)果表明rpoN突變株無(wú)法單獨(dú)利用這兩種氮源生長(zhǎng)。RT-qPCR分析發(fā)現(xiàn)，關(guān)鍵基因 nasT、nasR、nasF、nasB及glnA的表達(dá)相對(duì)野生型顯著下調(diào)。為了研究調(diào)節(jié)蛋白NasR、Na

4、sT的功能以及它們參與的硝酸鹽同化調(diào)節(jié)機(jī)制，分別構(gòu)建了nasR與nasT插入突變株。當(dāng)nasT突變后，A1501攝取硝酸鹽能力不變，卻無(wú)法利用該氮源進(jìn)行生長(zhǎng)；當(dāng) nasR突變后，A1501攝取、利用硝酸鹽的能力分別下降了60％與40%。分析A1501基因組中nasT與nasR的位置，發(fā)現(xiàn)nasT位于還原酶編碼基因上游，而nasR位于轉(zhuǎn)運(yùn)體編碼基因上游，這與兩個(gè)突變株呈現(xiàn)出的表型相呼應(yīng)，表明NasT可能參與調(diào)控下游還原酶編碼基因的表達(dá)，而

5、NasR則可能參與調(diào)控下游轉(zhuǎn)運(yùn)體編碼基因的表達(dá)。
　　3.序列分析表明調(diào)節(jié)蛋白編碼基因nasR和nasT啟動(dòng)子區(qū)均有RpoN保守結(jié)合位點(diǎn)，但尚未有 RpoN直接作用于這兩個(gè)基因啟動(dòng)子區(qū)的報(bào)道。本研究利用His-Tag表達(dá)體系體外純化 RpoN蛋白，分別將RpoN蛋白、RpoN-核心酶復(fù)合體與地高辛標(biāo)記的nasR和nasT啟動(dòng)子序列進(jìn)行體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)RpoN與核心酶組成的RNA聚合酶全酶能夠特異性地與nasR、nasT啟動(dòng)子