雙相陶瓷生物活性骨的制備及其細(xì)胞相容性研究

1、<p>　　雙相陶瓷生物活性骨的制備及其細(xì)胞相容性研究</p><p>　　作者：彭吾訓(xùn)，王蕾，李彥林，修曉光，趙宏斌，龔躍昆，趙學(xué)凌，李世和，胡蘊(yùn)玉</p><p>　　【摘要】 ［目的］制備一種雙相陶瓷生物活性骨，并了解其細(xì)胞相容性。［方法］ 分離培養(yǎng)兔骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymalstemcells， MSCs)，將濃度為1×106／ml的第3代MSCs

2、接種于復(fù)合有I型膠原、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetk protein，BMP)和堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)的雙相陶瓷生物骨(bniphask ceramic bioiogic bone，BCBB)上，聯(lián)合培養(yǎng)，用倒置相差顯微鏡、掃描電子顯微鏡觀察，測(cè)定光密度（OD）值，了解雙相陶瓷生物活性骨BCBB／BMP／bFGF的細(xì)胞相容性。［結(jié)果］BCBB孔

3、內(nèi)充滿I型膠原、BMP及bFGF。MSCs在雙相陶瓷生物活性骨BCBB／BMP／bFGF上黏附生長，第6 d時(shí)細(xì)胞在材料表面形成致密細(xì)胞層，增殖達(dá)穩(wěn)定狀態(tài)。［結(jié)論］該研究制備的雙相陶瓷生物活性骨BCBB／BMP／bFGF具有良好的細(xì)胞相容性。 </p><p>　　【關(guān)鍵詞】 雙相陶瓷生物骨； 骨形態(tài)發(fā)生蛋白； 堿性成纖維細(xì)胞生長因子； 骨髓基質(zhì)干細(xì)胞； 生物相容性</p><p>　　

4、Abstract: ［Objective］To prepare a kind of biphasic ceramic biologic active bone and study its biocompatibility. ［Method］Biphasic ceramic biologic bone(BCBB) was mixed with collage type I, bone morphogenetic protein (BMP)

5、 and basic fibroblast growth factor (bFGF) , and then the third generation cultured rabbit bone mesenchymal stem cells (MSCs) were seeded on BCBB/BMP/bFGF in vitro.The tissue engineering bone(BCBB/BMP/bFGF/MSCs) was obse

6、rved by upside down microscope, scanning electron microscope</p><p>　　Key words：biphasic ceramic biologic bone(BCBB); bone morphogenetic protein; basic fibroblast growth factor; mesenchymal stem cells

7、; biocompatibility</p><p>　　骨組織工程的研究主要集中在支架材料、種子細(xì)胞、生長因子、組織器官的構(gòu)建等方面，而支架材料細(xì)胞相容性是材料能否應(yīng)用于臨床的重要因素。骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells， MSCs)是目前骨組織工程最有臨床應(yīng)用前景的種子細(xì)胞［1］。骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)和堿性成纖維細(xì)胞生長因

8、子(basic fibroblastg rowth factor，bFGF)是近來研究得較深入的兩種骨生長因子［2］。本研究將兔MSCs分離培養(yǎng)后，與復(fù)合有BMP和bFGF的雙相陶瓷生物骨(biphasic ceramic biologic bone，BCBB)聯(lián)合培養(yǎng)，了解雙相陶瓷生物活性骨BCBB／BMP／bFGF的細(xì)胞相容性，為進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。</p><p><b>　　1 材料和方法&l

9、t;/b></p><p>　　1.1 雙相陶瓷生物活性骨(BCBB／BMP／bFGF)的制備</p><p>　　BMP由第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院全軍骨科研究所提供，已經(jīng)小鼠肌袋實(shí)驗(yàn)證明有骨誘導(dǎo)活性。稱取600 mg BMP溶于10 ml濃度為4 mol／L鹽酸胍溶液中，置4℃冰箱中保存24 h后，取出后勻漿，然后4℃透析48 h，每24 h更換透析液1次，得到BMP溶液。取堿性成纖

10、維細(xì)胞生長因子(bFGF)每支150萬IU／mg，用1 ml蒸餾水溶解后，分裝為10份，每份100 μL含bFGFl5萬IU。分別各取bFGF溶液96 000 IU(64 000 ng)。取I型膠原溶液20 ml，與上述BMP溶液和bFGF溶液混合，電磁震蕩器震蕩10 min，將混合液與60塊0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm大小的BCBB骨粒及5 mm×5 mm×1 mm薄片20塊充分混勻

11、(每塊骨粒含BMP10 mg，bFGF 1 600 IU)，負(fù)壓抽吸、凍干，制得雙相陶瓷生物活性骨。環(huán)氧乙烷消毒后無菌條件下封裝備用，同時(shí)留樣品送細(xì)菌培養(yǎng)，并證實(shí)無細(xì)菌生長。</p><p>　　1.2 雙相陶瓷生物活性骨的結(jié)構(gòu)觀察</p><p>　　從凍干后的雙相陶瓷生物活性骨中取樣，做掃描電鏡(SEM)觀察。</p><p>　　1.3 MSCs的分離培養(yǎng)

12、</p><p>　　兩周齡日本大耳兔5只，昆明醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供，體重約150～200 g(合格證號(hào)：滇實(shí)動(dòng)證第2003064號(hào))。脫頸處死，0.1%的新潔爾滅中浸泡10 min，無菌條件下剝離出雙側(cè)股骨、脛骨，PBS沖洗3遍。注射器吸取L-DMEM培養(yǎng)基沖洗股骨、脛骨髓腔，將含有骨髓的沖洗液轉(zhuǎn)入離心管， 800 r／min離心10 min，棄去上清液，加入L-DMEM完全培養(yǎng)基10 ml(青霉素100 U／

13、ml，鏈霉素100 μg／ml，15%新生牛血清，HEPES 0.0l mol／L)，吹打均勻后加入2個(gè)底面積為25 cm2的培養(yǎng)瓶中，置37℃，5%CO2飽和濕度培養(yǎng)。視情況每2～3 d全量換液一次。當(dāng)原代細(xì)胞融合并覆蓋瓶底80%以上時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化，按1∶2比例傳代培養(yǎng)。取第3代細(xì)胞與雙相陶瓷生物活性骨復(fù)合培養(yǎng)。</p><p>　　1.4 雙相陶瓷生物活性骨與MSCs的復(fù)合培養(yǎng)</p&g

14、t;<p>　　1.4.1 MSCs在雙相陶瓷生物活性骨上增殖的倒置相差顯微鏡觀察及MTT法測(cè)定</p><p>　　分別將5 mm×5 mm×1 mm BCBB材料20塊置于5塊96孔培養(yǎng)板中預(yù)濕，每塊板的A1、A2、A3、A4孔各放1塊BCBB／BMP／bFGF材料。4 h后將密度為1×106／ml的第3代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞20 μl接種于96孔培養(yǎng)板的預(yù)濕材料上，

15、CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，再分別加80 μl含15%新生牛血清的L-DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，A9、A10、A11、A12孔單純加相同培養(yǎng)基作為本底，每1 d換液一次。倒置相差顯微鏡觀察。分別在第1、2、3、6、8 d時(shí)取出1塊板加MTT10 μl，4 h后加三聯(lián)液100 μl，12 h后用酶標(biāo)檢測(cè)儀在570 nm波長下測(cè)定各孔光密度(OD)值。根據(jù)細(xì)胞在材料上的增殖曲線確定最佳移植時(shí)機(jī)。</p><p>　　1.

16、4.2 雙相陶瓷生物活性骨與MSCs聯(lián)合培養(yǎng)的SEM觀察</p><p>　　將5 mm×5 mm×5 mm的雙相陶瓷生物活性骨10塊預(yù)濕后按1×106／ml濃度接種細(xì)胞，置培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，第3、6 d分別取出材料各5塊，用2.5%戊二醛固定15 min，干燥后于掃描電子顯微鏡觀察細(xì)胞在材料上黏附、增殖情況。</p><p><b>　　2 結(jié)果&

17、lt;/b></p><p>　　2.1 雙相陶瓷生物活性骨的結(jié)構(gòu)觀察</p><p>　　鏡下(SEM×100)可見BCBB孔內(nèi)充滿I型膠原、BMP及bFGF，可見I型膠原和BMP呈云絮狀或網(wǎng)紗狀，bFGF呈層片狀(圖1)。</p><p>　　2.2 MSCs體外培養(yǎng)的倒置相差顯微鏡觀察</p><p>　　原代培養(yǎng)2

18、4 h時(shí)部分細(xì)胞開始貼壁伸展變形，剛貼壁的細(xì)胞單個(gè)排列，呈圓形或多角形，胞體透亮折光性強(qiáng)。48～72 h后呈紡錘形或梭形，每個(gè)細(xì)胞形成一個(gè)集落，增殖迅速，集落之間相互靠近。5 d后見貼壁生長的細(xì)胞數(shù)量明顯增多，細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)較大變化，可見成纖維樣細(xì)胞散布于培養(yǎng)瓶底，并有集落形成，細(xì)胞圍繞中心呈漩渦狀排列，隨之集落逐漸增多、增大，并融合為單層。8 d時(shí)細(xì)胞基本長滿瓶底，呈長梭形，有的細(xì)胞呈交叉重疊生長。原代細(xì)胞培養(yǎng)8～12 d后傳代，傳代細(xì)

19、胞貼壁較快，剛傳代時(shí)呈圓形，可見大量細(xì)胞懸浮，核透亮，2 h后少量細(xì)胞開始貼壁，細(xì)胞形態(tài)由圓形向梭形轉(zhuǎn)化，之后可見細(xì)胞貼壁散在分布，貼壁細(xì)胞呈單層生長，伸展為梭形。第3代細(xì)胞形態(tài)為成纖維細(xì)胞樣，細(xì)胞形態(tài)趨于一致，核分裂相多見，第5 d基本長滿瓶底(圖2)，取此代細(xì)胞與材料復(fù)合。</p><p>　　2.3 雙相陶瓷生物活性骨與MSCs聯(lián)合培養(yǎng)的倒置相差顯微鏡觀察</p><p>　　由于

20、材料透光性差，倒置顯微鏡無法直接觀察細(xì)胞在BCBB表面生長情況，可觀察到貼附在BCBB孔隙邊緣的MSCs，并見細(xì)胞貼附于培養(yǎng)板底生長。培養(yǎng)3 d的載體上可見有少量細(xì)胞生長，形態(tài)不規(guī)則；培養(yǎng)6 d的載體上細(xì)胞明顯增多，有的細(xì)胞突起與其他胞體相連。</p><p>　　2.4 雙相陶瓷生物活性骨與MSCs聯(lián)合培養(yǎng)的SEM觀察</p><p>　　在培養(yǎng)3 d的載體上可見有少量細(xì)胞生長，形態(tài)不

21、規(guī)則，培養(yǎng)6 d的載體上細(xì)胞明顯增多(圖3)，可見少數(shù)細(xì)胞變圓，為處于分裂期細(xì)胞，多數(shù)細(xì)胞呈長梭形，隨材料表面特征成一定方向排列。細(xì)胞表面有多個(gè)細(xì)長突起，細(xì)胞突起交互連接呈網(wǎng)狀，有的與其他胞體相連。</p><p>　　2.5 雙相陶瓷生物活性骨與MSCs聯(lián)合培養(yǎng)的MTT法測(cè)定</p><p>　　第1，2，3，6，8 d時(shí)取出一塊板加MTT進(jìn)行OD值測(cè)定，細(xì)胞在材料上增殖的OD值如表所

22、示(表1)，用聯(lián)合培養(yǎng)組OD值減去本底的OD值，根據(jù)所得結(jié)果制出增殖曲線。MSCs的生長曲線呈S形，傳代接種后第1～3 d細(xì)胞增殖緩慢為潛伏適應(yīng)期，此期主要為MSCs的貼壁生長階段。從第4 d開始細(xì)胞增殖加速，細(xì)胞曲線顯示此階段細(xì)胞數(shù)目呈指數(shù)級(jí)遞增，此期為MSCs的對(duì)數(shù)生長期。第6 d達(dá)到頂點(diǎn)后，細(xì)胞不再增殖，生長活動(dòng)停滯， MSCs生長進(jìn)入一個(gè)平臺(tái)期。之后，細(xì)胞數(shù)量輕度下降。第6 d時(shí)，MSCs載體聯(lián)合培養(yǎng)細(xì)胞增殖達(dá)穩(wěn)定期，此時(shí)為移

23、植的最佳時(shí)機(jī)(圖4)。表1 細(xì)胞在材料上增殖的OD值</p><p><b>　　3 討論</b></p><p>　　評(píng)價(jià)材料生物相容性的方法主要有兩種：一種是體內(nèi)直接植入法，即將材料植入體內(nèi)，不同時(shí)間段取出作大體和組織學(xué)檢查；另一種是體外復(fù)合細(xì)胞培養(yǎng)法，即將材料與細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，檢測(cè)細(xì)胞的增殖與功能情況。體外復(fù)合細(xì)胞培養(yǎng)法是近年來采用的主要方法。它對(duì)材料毒性

24、敏感性高、重復(fù)性好，簡便、易行、快速、易于控制實(shí)驗(yàn)條件［3］。該實(shí)驗(yàn)用BCBB為支架，用免疫原性低、生物相容性好、支持成骨細(xì)胞黏附分化的I型膠原修飾BCBB表面［4］，并復(fù)合以促進(jìn)成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞分化增殖的BMP和bFGF［2］，制成雙相陶瓷生物活性骨。掃描電鏡觀察到I型膠原、BMP、bFGF有效地復(fù)合到了雙相陶瓷生物骨(BCBB)上，制得雙相陶瓷生物活性骨，將其與MSCs復(fù)合培養(yǎng)。 圖1鏡下可見BCBB孔內(nèi)充滿I型膠原、BMP及

25、bFGF(SEM×l00)</p><p>　　圖4BMSCs與雙相陶瓷生物活性骨聯(lián)合培養(yǎng)的細(xì)胞增殖曲線 MSCs體外長期培養(yǎng)往往存在細(xì)胞老化及生物學(xué)功能退變等問題［5］。在該實(shí)驗(yàn)中，MSCs經(jīng)3次傳代體外培養(yǎng)不斷純化后獲得的MSCs其純度較高、增殖生長能力強(qiáng)。因此作者選擇取第3代細(xì)胞與雙相陶瓷生物活性骨復(fù)合培養(yǎng)。</p><p>　　MSCs的數(shù)量及密度直接影響其增生和分

26、化。目前國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道MSCs在支架材料上的移植濃度多為5×105～7.5×106個(gè)／ml［5］，本研究將濃度為1×106／ml的MSCs種植于雙相陶瓷生物活性骨上，在體外進(jìn)行三維立體培養(yǎng)，用二甲基四氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法(MTT法)測(cè)定細(xì)胞與材料聯(lián)合培養(yǎng)時(shí)增殖達(dá)穩(wěn)定狀態(tài)的時(shí)間，通過測(cè)定OD值間接反映細(xì)胞生長及增殖活性［6］。根據(jù)增殖曲線變化確定第6 d時(shí)細(xì)胞在材料表面形成致密細(xì)胞層，可見細(xì)胞突起交錯(cuò)，細(xì)胞

27、在材料表面生長狀態(tài)良好，細(xì)胞增殖達(dá)穩(wěn)定狀態(tài)。表明該雙相陶瓷生物活性骨具有良好的細(xì)胞黏附性和細(xì)胞相容性。</p><p>　　總之，MSCs能在雙相陶瓷生物活性骨(BCBB／BMP／bFGF)表面黏附生長、增殖，雙相陶瓷生物活性骨具有較好的細(xì)胞相容性。第6 d時(shí)，MSCs與雙相陶瓷生物活性骨聯(lián)合培養(yǎng)細(xì)胞增殖達(dá)穩(wěn)定期，構(gòu)建了理想的組織工程骨，表明MSCs與雙相陶瓷生物活性骨聯(lián)合培養(yǎng)構(gòu)建組織工程骨是可行的。但是本實(shí)驗(yàn)尚

28、屬初步觀察，還需要體內(nèi)成骨定量、成血管和骨修復(fù)等進(jìn)一步研究。</p><p><b>　　【參考文獻(xiàn)】</b></p><p>　?。?］ Xie C, Keynolds D, Awad H, et al. Structural bone allograft combined with genetically engineered mesenchymal stem c

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