生物科學(xué)畢業(yè)論文基于線粒體dna co?；蛐蛄醒芯克膫€(gè)長(zhǎng)蛸octopus variabilis野生群體的遺傳多樣性

1、<p><b>　　本科畢業(yè)論文</b></p><p><b>　?。?0 屆）</b></p><p>　　基于線粒體DNA COⅢ基因序列研究四個(gè)長(zhǎng)蛸Octopus variabilis野生群體的遺傳多樣性</p><p>　　所在學(xué)院 </p

2、><p>　　專業(yè)班級(jí) 生物科學(xué) </p><p>　　學(xué)生姓名 學(xué)號(hào) </p><p>　　指導(dǎo)教師 職稱 </p><p>　　完成日期 年 月 </p>

3、<p><b>　　目錄</b></p><p><b>　　摘要I</b></p><p>　　AbstractII</p><p><b>　　引言1</b></p><p><b>　　1材料與方法2</b></p>

4、<p>　　1.1實(shí)驗(yàn)材料2</p><p>　　1.2實(shí)驗(yàn)儀器2</p><p>　　1.3實(shí)驗(yàn)方法2</p><p>　　1.3.1長(zhǎng)蛸基因組DNA的提取2</p><p>　　1.3.2凝膠電泳檢測(cè)DNA3</p><p>　　1.3.3長(zhǎng)蛸線粒體DNA COⅢ基因-PCR反應(yīng)體

5、系優(yōu)化3</p><p>　　1.3.4PCR產(chǎn)物的測(cè)序和分析3</p><p>　　1.4本章小結(jié)4</p><p><b>　　2結(jié)果與分析5</b></p><p>　　2.1長(zhǎng)蛸DNA提取5</p><p>　　2.2COⅢ-PCR引物設(shè)計(jì)5</p>&

6、lt;p>　　2.3PCR體系優(yōu)化5</p><p>　　2.3.1正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)5</p><p>　　2.3.2兩個(gè)因素的梯度實(shí)驗(yàn)6</p><p>　　2.3.3正交試驗(yàn)的結(jié)果7</p><p>　　2.3.4退火溫度梯度實(shí)驗(yàn)8</p><p>　　2.3.5正交試驗(yàn)結(jié)果8</p

7、><p>　　2.4PCR反應(yīng)結(jié)果9</p><p>　　2.4.1PCR最優(yōu)反應(yīng)體系9</p><p>　　2.4.2測(cè)序9</p><p>　　2.5長(zhǎng)蛸COⅢ基因序列分析結(jié)果9</p><p>　　2.6本章小結(jié)12</p><p><b>　　3討論14<

8、;/b></p><p><b>　　小結(jié)19</b></p><p><b>　　參考文獻(xiàn)20</b></p><p><b>　　致謝24</b></p><p><b>　　摘要</b></p><p>　　[摘要

9、] 目的 長(zhǎng)蛸是我國(guó)傳統(tǒng)海產(chǎn)，具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值，對(duì)我國(guó)沿海四個(gè)地區(qū)長(zhǎng)蛸野生群體進(jìn)行遺傳多樣性分析，是海洋生態(tài)學(xué)以及水產(chǎn)資源學(xué)不可缺少的應(yīng)用基礎(chǔ)性的研究工作。本實(shí)驗(yàn)是對(duì)大連、青島、舟山、廈門四個(gè)地區(qū)的長(zhǎng)蛸Octopus variabilis線粒體DNA COⅢ基因序列的測(cè)定來(lái)研究四個(gè)野生群體的遺傳多樣性，從而討論遺傳多樣性與遺傳變異之間的關(guān)系。方法 取長(zhǎng)蛸外套肌組織，采用《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》蛋白酶K、酚/氯仿提取法（稍作修改）提取基因組D

10、NA。細(xì)胞色素氧化酶亞基Ⅲ基因片斷的擴(kuò)增引物源自A. L. Allcock的一篇文獻(xiàn)，COⅢ基因片段的兩條引物分別為：F1 (5′ CAATG ATGAC GAGAT ATTAT YCG 3′), R1 (5′ TCAAC AAAGT GTCAG TATCA 3′)。在合適的反應(yīng)條件下，通過(guò)PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因，并對(duì)其進(jìn)行純化，純化后的產(chǎn)物送交上海英駿生物技術(shù)公司測(cè)序。結(jié)論 由PCR擴(kuò)增和測(cè)序獲得COⅢ基因504 bp的序列57個(gè)，其

11、多態(tài)性遺傳參數(shù)統(tǒng)計(jì)顯示，COⅢ基因檢出9個(gè)單倍型，總?cè)后w單倍型多樣性指數(shù)(Hd) 為0.802 (COⅢ)，核苷酸</p><p>　　[關(guān)鍵詞] 長(zhǎng)蛸；COⅢ；遺傳多樣性；分子標(biāo)記技術(shù)</p><p><b>　　Abstract</b></p><p>　　[Abstract] Purpose Octopus variabilis is

12、traditional Chinese seafood, with the important economic value. the four regions of coastal octopus of wild populations are being genetic diversity, which are also basic to studies on marine ecology and fishery resources

13、. This experiment is to Octopus variabilis of four districts of dalian, Qingdao, zhoushan, xiamen mitochondrial DNA was reviewed，and the determination of COⅢ gene sequences to study the genetic diversity of the four wild

14、 population genetic</p><p>　　[Key words] Octopus variabilis; COⅢ; Genetic diversity; Molecule marker technology </p><p><b>　　引言</b></p><p>　　長(zhǎng)蛸學(xué)名Octopus variabilis,隸屬軟體動(dòng)

15、物門，頭足綱，八腕目，蛸科(Octopodidae)，俗稱長(zhǎng)八帶魚(yú)(短蛸俗稱八帶魚(yú))、鲅須。 胴部短小，亞圓或卵圓形。頭足部具有肉腕4對(duì)，一般腕的長(zhǎng)度相當(dāng)于胴部的2～5倍，腕上有大小不一的吸盤。無(wú)肉鰭，殼退化。真蛸體中型，一般全長(zhǎng)50厘米。胴部橢圓形，背部有疣突起。各腕長(zhǎng)度相近，側(cè)腕稍長(zhǎng)，腹腕稍短，腕上具吸盤4個(gè)。體褐色，胴背具十分明顯的灰白色斑點(diǎn)長(zhǎng)蛸體中型，全長(zhǎng)50～70厘米。胴部呈長(zhǎng)橢圓形，表面光滑。頭部狹，眼小。腕長(zhǎng)，各腕長(zhǎng)短懸殊

16、。其中第1對(duì)腕最粗最長(zhǎng)，約40～50厘米，是第4對(duì)腕長(zhǎng)度的2倍。骯上有吸盤2行。體粉紅色。</p><p>　　長(zhǎng)蛸在我國(guó)南北各海區(qū)均有廣泛分布，其中北部海區(qū)略多。長(zhǎng)蛸個(gè)體大、肉質(zhì)肥厚鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富，富含蛋白質(zhì)和氨基酸，可食用部分占總體的90％以上。肉除鮮食外，還可以加工成干制品，食用方式多種多樣。其內(nèi)骨骼(中藥名海螵蛸)和墨囊具有較高的藥用價(jià)值，有止血、抗癌等功效。因而長(zhǎng)蛸具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。目前我國(guó)產(chǎn)長(zhǎng)蛸除少

17、量?jī)?nèi)銷外，大多數(shù)出口韓國(guó)，供不應(yīng)求。</p><p>　　在天然海區(qū)長(zhǎng)蛸主要營(yíng)底棲生活，為沿岸底棲種類。春季長(zhǎng)蛸多在低潮線以上活動(dòng)，夏秋兩季多在潮間帶中區(qū)，冬季則在潮下帶深潛，具有短距離的生殖和越冬洄游習(xí)性。其多利用腕足在海底爬行，也能憑借漏斗噴水的反作用短暫游行于底層海水中。其生活場(chǎng)所多為泥底，少數(shù)為沙泥底或礁石底。長(zhǎng)蛸可用其腕足挖洞棲居，尤其在其繁殖季節(jié)。天然海區(qū)長(zhǎng)蛸多將卵產(chǎn)在自挖的洞中孵化，少數(shù)產(chǎn)在礁石縫隙

18、及海螺殼中。主要以蟹類、蝦類、貝類和底棲魚(yú)類為食，其攝食兇猛，通常在夜間進(jìn)行攝食活動(dòng)。遇敵害或受到驚擾時(shí)會(huì)噴射墨狀液體掩護(hù)其逃走。</p><p>　　目前，有關(guān)長(zhǎng)蛸的研究主要集中在形態(tài)學(xué)、組織學(xué)、生理生態(tài)、人工育苗及養(yǎng)殖等方面[1~5]。分子遺傳學(xué)方面的研究不多，僅見(jiàn)高強(qiáng)等[6~7]采用等位酶技術(shù)對(duì)我國(guó)渤海海域長(zhǎng)蛸群體的遺傳變異進(jìn)行了分析，?？姑赖萚8] 、孫寶超等[9]對(duì)中國(guó)沿海長(zhǎng)蛸群體線粒體COI的遺傳變異

19、進(jìn)行了研究，李煥等[10]研究了中國(guó)沿海四個(gè)長(zhǎng)蛸群體16S rRNA基因的遺傳變異。在此研究背景下，本文采用線粒體基因COⅢ序列分析技術(shù)對(duì)黃海、渤海、東海4個(gè)地理群體長(zhǎng)蛸資源的遺傳變異和種群結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，從而研究遺傳多樣性與遺傳變異之間的關(guān)系。</p><p><b>　　材料與方法</b></p><p><b>　　實(shí)驗(yàn)材料 </b><

20、/p><p>　　從遼寧大連(DL)、山東青島(QD)、浙江舟山(ZS)、福建廈門(XM)四個(gè)海域捕獲長(zhǎng)蛸的活體新鮮肌肉放置于95%酒精，-70℃低溫冰箱中保存以備用；COⅢ基因引物由上海英駿生物技術(shù)公司合成；Taq酶、10×PCR Buffer 緩沖液、25mmol/L MgCl2、2.5mmol/L dNTPs、電泳Marker、6×Loading-Buffer 、蛋白酶K；無(wú)水乙醇

21、、STE緩沖液、SDS、Tris飽和酚、氯仿、異戊醇、5mol/L NaCl溶液、瓊脂糖、EB染色液、去離子水。</p><p><b>　　實(shí)驗(yàn)儀器</b></p><p>　　立式高壓蒸汽滅菌鍋（YXQ-LS-OS11型，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司）；PCR儀（PTC-200型，BIO-RAD）；移液器（1000µl、200µl、100µl

22、、10µl、2.5µl，國(guó)產(chǎn)大龍牌）；水平電泳儀（DYY-8C型，北京六一儀器廠）；電子天平（EL104型，METTLER-TOLEDO）；數(shù)顯水浴鍋（HH-6型，國(guó)華電器）；凝膠成像系統(tǒng)（VH II型，BIO-RAD）；冷凍離心機(jī)（GL-16G-II型，國(guó)產(chǎn)飛鴿牌）。</p><p>　　實(shí)驗(yàn)方法

23、 </p><p>　　長(zhǎng)蛸基因組DNA的提取</p><p>　　剪取小塊的長(zhǎng)蛸肌肉組織0.1g放入2000μlEP管；</p><p>　　加600µl的STE緩沖液+60µl的SDS(10%)，剪碎后加6µl的PK；</p><p>　　55℃水浴消化3-3.5h，至溶液澄清，無(wú)沉淀（其中前半

24、個(gè)小時(shí)消化時(shí)，每5min搖一次，使溶液充分混合，充分消化）；</p><p>　　加入330µl氯仿/異戊醇二相混合液（氯仿：異戊醇=24:1）+330µl (等體積) Tris飽和酚，緩慢搖晃15min，使之充分混合；</p><p>　　離心，控溫4℃，12000rpm，離心15min；</p><p>　　取上清至新的離心管重復(fù)4、5步驟兩

25、次（等體積2相+1相混合）；</p><p>　　加入等體積的二相（氯仿：異戊醇=24:1）充分，緩慢搖晃15min，控溫4℃，12000rpm，離心15min；</p><p>　　取上清加入新的離心管中，加入1/25體積的5mol/L NaCl溶液和2.5倍體積無(wú)水乙醇（-20℃），充分混勻（搖15min），-20℃下靜置1h后離心15min；</p><p>

26、　　去上清，留沉淀，加入70%酒精（-20℃）搖晃幾次，靜置7-8min， 控溫4℃，12000rpm, 離心8min；</p><p>　　重復(fù)第九步一次，去上清，留沉淀，使酒精揮發(fā)干，加入100µl去離子水，-4℃保存。</p><p><b>　　凝膠電泳檢測(cè)DNA</b></p><p>　　1%瓊脂糖凝膠制備，1.0克的瓊脂

27、糖，加入100ml的0.5×TBE，微波加熱，至溶液澄清即成1%的瓊脂糖凝膠；</p><p>　　用25格的梳子倒平板，等待膠冷卻成型，倒膠的時(shí)候注意膠內(nèi)不能有氣泡，以免影響膠成像的效果；</p><p>　　混合2.5µl 6×Loading-buffer和5µlDNA水溶液； </p><p>　　控制電壓100V，電泳

28、分離40min；</p><p>　　將電泳之后的凝膠放入EB溶液中染色20min；</p><p>　　紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果，拍攝照片。</p><p>　　長(zhǎng)蛸線粒體DNA COⅢ基因-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化</p><p>　　1. COⅢ基因片斷的擴(kuò)增引物源自文獻(xiàn)[15~18]，COⅢ基因片段的兩條引物分別為：F1: 5′ CAATG

29、 ATGAC GAGAT ATTAT YCG 3′, R1: 5′ TCAAC AAAGT GTCAG TATCA 3′。</p><p>　　2. 反應(yīng)體系成分：反應(yīng)體系成分主要需要優(yōu)化的是鎂離子含量，反應(yīng)體系成分為：總體積25 µl，其中2.5µl 10× Buffer、0.25µl 25mmol/L dNTPs、l0 umol/L引物各2.5 µl、5 U/

30、µl Taq DNA polymerase 0.25 µl、20 mmol/L Mg2+ 2.5 µl、ddH2O 13.5 µl；</p><p>　　3.反應(yīng)條件優(yōu)化的主要對(duì)象是退火溫度，PCR反應(yīng)程序設(shè)計(jì)步驟：94 ℃預(yù)變性5 min, 94 ℃ 40 s, 50 ℃ 40 s, 72 ℃ 90 s, 38個(gè)循環(huán)后，72 ℃延伸10 min；</p>&

31、lt;p>　　4. 以簡(jiǎn)單正交原理實(shí)施針對(duì)鎂離子濃度和退火溫度的梯度實(shí)驗(yàn)；</p><p>　　5. 反應(yīng)結(jié)束后的PCR產(chǎn)物，用1.3.2的方法進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)，以確定最優(yōu)體系。</p><p>　　PCR產(chǎn)物的測(cè)序和分析</p><p>　　1. 檢測(cè)之后效果良好的PCR產(chǎn)物送交上海英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序；</p><p>　　2.

32、 序列結(jié)果利用MEGA3.1軟件[11]中的ClustalX插件[12]進(jìn)行DNA序列排列，并輔以人工較對(duì)。用MEGA3.1軟件進(jìn)行序列比較和變異檢測(cè)，確定變異位點(diǎn)和單倍型；</p><p>　　3. 用DnaSP4.10軟件[13]計(jì)算核苷酸多樣性(Nucleotide diversity, π)、單倍型多樣性(haplotype diversity, h)和核苷酸歧異度(Pairwise divergence

33、)；</p><p>　　4. 用Arlequin3.01軟件[14]中的分子變異分析(AMOVA)方法估算遺傳變異在群體內(nèi)和群體間的分布，并計(jì)算群體間遺傳分化系數(shù)(F-statistics, Fst)及其顯著性（重復(fù)次數(shù)1000），種群間基因流用Nm來(lái)估計(jì)：Nm= (1/ Fst -1)/2。</p><p><b>　　本章小結(jié)</b></p>&l

34、t;p>　　1.本實(shí)驗(yàn)所用的引物是目前普遍使用的源自文獻(xiàn)[15]中的兩段引物，分別是 F1: 5′ CAATG ATGAC GAGAT ATTAT YCG 3′, R1: 5′ TCAAC AAAGT GTCAG TATCA 3′。</p><p>　　2.我們提取長(zhǎng)蛸DNA所選用的方法是最常用的苯酚-氯仿法提取，在實(shí)驗(yàn)初期由于使用蛋白酶K的量不準(zhǔn)確，使得跑電泳得到的DNA條帶結(jié)果不理想，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。經(jīng)過(guò)

35、多次嘗試，終于得到了理想的DNA條帶。</p><p>　　3.凝膠電泳檢測(cè)DNA過(guò)程中我們使用的是1%的瓊脂糖凝膠，跑電泳時(shí)間我們?cè)O(shè)置在40到45分鐘，確保跑膠得到的DNA條帶處在整條帶的2/3處。</p><p><b>　　結(jié)果與分析</b></p><p><b>　　長(zhǎng)蛸DNA提取</b></p>

36、<p>　　從遼寧大連(DL)、山東青島(QD)、浙江舟山(ZS)、福建廈門(XM)四個(gè)地區(qū)海域所采樣品中選取的57 個(gè)新鮮個(gè)體，取肌肉進(jìn)行DNA提取實(shí)驗(yàn)，圖1為苯酚-氯仿法提取的部分長(zhǎng)蛸DNA凝膠電泳測(cè)試結(jié)果：</p><p>　　由于DNA提取使用-70℃冷凍樣品，DNA部分降解，故凝膠檢測(cè)效果不夠理想，出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象。</p><p>　　COⅢ-PCR引物設(shè)計(jì)</p&

37、gt;<p>　　COⅢ基因片斷的擴(kuò)增引物源自文獻(xiàn)[15~18]，COⅢ基因片段的兩條引物分別為：F1: 5′ CAATG ATGAC GAGAT ATTAT YCG 3′, R1: 5′ TCAAC AAAGT GTCAG TATCA 3′。</p><p><b>　　PCR體系優(yōu)化</b></p><p>　　針對(duì)鎂離子濃度和退火溫度的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

38、，擬設(shè)計(jì)范圍：Mg2+濃度：1～2.5 mmol/L均衡四個(gè)梯度；退火溫度：50℃、50.6℃、51.2℃、51.7℃、52℃共5個(gè)梯度；正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1：</p><p>　　表1 安排了20個(gè)實(shí)驗(yàn)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)的鎂離子濃度和退火溫度為表格中顯示的數(shù)值</p><p>　　Table 1 Arrangement of 20 experiments, each experiment of

39、magnesium ion concentration and annealing temperature for the values ??shown in the table</p><p>　　針對(duì)兩個(gè)因素的梯度實(shí)驗(yàn)，安排每個(gè)實(shí)驗(yàn)反應(yīng)體系如表2。</p><p>　　表2 其中A～D四組分別依次代表實(shí)驗(yàn)1～20，每連續(xù)5個(gè)實(shí)驗(yàn)的體系成分相同，表中數(shù)據(jù)的單位均為(µl)，總

40、的反應(yīng)體系為25µl</p><p>　　Table 2 in which A ~ D, respectively, followed by representatives of four groups of experiment 1 to 20, each of 5 consecutive experiments of the system components the same unit of da

41、ta in the table are (μl), 25μl total reaction system</p><p>　　正交試驗(yàn)的結(jié)果，如下圖所示</p><p>　　從圖2可以看出，鎂離子濃度在2.0 mmol/L的時(shí)候PCR產(chǎn)物條帶清晰明了，而退火溫度好像沒(méi)有多大的影響，11～15號(hào)實(shí)驗(yàn)的條帶基本一致，所以就退火溫度再次展開(kāi)梯度實(shí)驗(yàn)。</p><p>　　

42、就退火溫度再次進(jìn)行梯度實(shí)驗(yàn)，本次實(shí)驗(yàn)的鎂離子濃度以2.0 mmol/L為最佳濃度，同樣安排20個(gè)實(shí)驗(yàn)，退火溫度依次為：47.3℃、48℃、48.8℃、50.1℃、51.7℃、53.6℃、55.1℃、57.2℃、57.8℃、58.4℃，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。</p><p>　　從圖3可以看出9、10號(hào)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果比較理想，電泳條帶比較清晰，9、10號(hào)實(shí)驗(yàn)對(duì)應(yīng)的退火溫度就是51.7℃，故可選擇52℃為最佳退火溫度。&l

43、t;/p><p>　　根據(jù)以上正交試驗(yàn)結(jié)果，可確定最佳鎂離子濃度為2.0mmol/L，最佳退火溫度為52℃，故COⅢ-PCR最優(yōu)反應(yīng)體系為：</p><p>　　最優(yōu)PCR反應(yīng)程序：預(yù)變性94℃ 5min， 然后—94℃ 40s—52℃ 40s—72℃ 90s—36個(gè)循環(huán)，72℃ 10min[15]。</p><p><b>　　PCR反應(yīng)結(jié)果</b&g

44、t;</p><p>　　據(jù)所得的PCR最優(yōu)反應(yīng)體系進(jìn)行大連、青島、舟山、廈門四個(gè)地區(qū)長(zhǎng)蛸COⅢ基因?qū)嶒?yàn)，共12個(gè)DNA模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，獲得如圖4的結(jié)果。</p><p>　　各條條帶都比較理想，片段產(chǎn)物的大小大約范圍為400～550bp</p><p>　　Figure 4, lane 1 is Marker, since the next followed

45、by Dalian, Qingdao, Zhoushan, Xiamen Octopus variabilis group of the three genes of individual CO Ⅲ,The roads are relatively good with the fragment about the size of the product range of 400 ~ 550bp</p><p>&

46、lt;b>　　測(cè)序 </b></p><p>　　把得到的12條理想的PCR產(chǎn)物送交上海英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序，PCR產(chǎn)物的大小在482bp～524bp。</p><p>　　長(zhǎng)蛸COⅢ基因序列分析結(jié)果</p><p>　　通過(guò)基因序列分析得到COⅢ基因片段同源序列504bp。各群體長(zhǎng)蛸COⅢ基因片段中T、A、C、G平均含量分別為41.2%、31

47、.4%、16.5%和10.9%，A+T含量(72.6% )明顯高于G+C含量(17.4% )。</p><p>　　57個(gè)COⅢ基因片段共檢測(cè)到55個(gè)變異位點(diǎn)，占分析位點(diǎn)總數(shù)的10.9 %，其中單突變位點(diǎn)2個(gè)，簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)53個(gè)，無(wú)插入或缺失位點(diǎn)。多態(tài)性遺傳參數(shù)統(tǒng)計(jì)顯示，57個(gè)個(gè)體共檢出9個(gè)單倍型（見(jiàn)表3），總?cè)后w單倍型多樣性指數(shù)(Hd)為0.802，核苷酸多樣性指數(shù)(Pi) 為0.045，平均核苷酸差異數(shù)(K)

48、為 22.628，顯示出較豐富的遺傳多樣性。</p><p>　　表3 長(zhǎng)蛸群體COⅢ基因序列單倍型及在群體中的分布</p><p>　　Tab 3 Haplotypes of COⅢ gene and its distribution in seven populations of O. variabilis</p><p>　　遺傳結(jié)構(gòu)分析方面，四個(gè)群體的COⅢ

49、基因序列比較結(jié)果表明，各群體在核苷酸組成上和遺傳參數(shù)上均存在顯著差異。廈門群體在核苷酸組成上與其他群體存在較大差異，如表3所示。遺傳參數(shù)統(tǒng)計(jì)表明，各群體多態(tài)位點(diǎn)比例在0.000%-1.389%之間；單倍型多樣性指數(shù)在0.000-0.885之間；核苷酸多樣性指數(shù)在0.000-0.007之間；平均核苷酸差異數(shù)在0.000-3.359之間，如表4所示。</p><p>　　各群體間的遺傳分化系數(shù)和基因流計(jì)算結(jié)果如表5所

50、示，廈門群體與其它群體之間分化系數(shù)高于其他群體之間的系數(shù)，且均達(dá)到極顯著水平(p﹤0.01)，基因流Nm也均小于1；大連、青島與舟山三個(gè)群體之間部分分化系數(shù)均不顯著(p﹥0.05)，大連與青島、舟山群體的遺傳分化系數(shù)為負(fù)值，說(shuō)明了群體內(nèi)的分化優(yōu)勢(shì)。AMOVA進(jìn)一步分析顯示在整個(gè)遺傳變異中有6.10%存在于群體內(nèi)部，93.90%存在于群體之間，支持長(zhǎng)蛸群體間的分化。 </p><p>　　經(jīng)MEGA 3.1軟件的N

51、J聚類分析（如圖5）結(jié)果表明，所有個(gè)體可以明顯聚為2支，廈門群體所有個(gè)體組成一支，另一支由其余三個(gè)群體的個(gè)體組成；遺傳距離分析表明，廈門群體與其它3群體的凈遺傳距離為0.101-0.102，其余3個(gè)群體之間的凈遺傳距離為0.000；四個(gè)群體的Tajima’s D和Fu’s Fs檢驗(yàn)結(jié)果表明，所有群體的Tajima’s D和Fu’s Fs值均為正值，且均未達(dá)到顯著水平(p﹥0.05)，因此這些群體可能未經(jīng)歷過(guò)歷史擴(kuò)張事件。</p&g

52、t;<p><b>　　本章小結(jié)</b></p><p>　　通過(guò)提取的四個(gè)海域長(zhǎng)蛸DNA COⅢ基因的分析結(jié)果，我們可以得出，各群體之間均存在著遺傳差異，但是廈門群體與其他三個(gè)群體之間的遺傳差異更顯著，以至于獨(dú)立形成了一個(gè)支。因此，通過(guò)我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，大連、青島，舟山三個(gè)海域的長(zhǎng)蛸群體聚合形成一個(gè)大類群，而廈門海域的長(zhǎng)蛸群體很有可能已單獨(dú)形成另一個(gè)類群。</p&

53、gt;<p>　　圖5 基于COⅢ序列的長(zhǎng)蛸不同個(gè)體的NJ聚類分析圖</p><p>　　Fig 5 NJ tree of COⅢ gene constructed from genetic distance among O.variabilis individuals </p><p>　　注：DL 、QD、ZS、XM分別代表大連、青島、舟山和廈門群體</p>

54、<p>　　Note: DL, QD, ZS and XM represent Dalian, Qingdao, Zhoushan and Xiamen population, respectively</p><p><b>　　討論</b></p><p>　　物種的遺傳變異一般能體現(xiàn)該物種適應(yīng)環(huán)境變化能力的強(qiáng)弱，遺傳變異較低的物種的種群恢復(fù)力偏低，更

55、承擔(dān)著種群滅絕的高風(fēng)險(xiǎn)，而遺傳變異較高的物種則具有較高的進(jìn)化潛能和生態(tài)適應(yīng)性[19]。頭足類是公認(rèn)的遺傳變異相對(duì)貧乏的生物物種，除KATUGIN O N. 等[20]提到的個(gè)別種類外，頭足類均顯現(xiàn)出較低的遺傳變異水平，如此低的遺傳變異水平通常僅發(fā)生在種群嚴(yán)重衰退的群體中，而在任何其他的無(wú)脊椎動(dòng)物群體中則很少見(jiàn)[21~22]，但是本文針對(duì)COⅢ基因的研究結(jié)果表明我國(guó)的長(zhǎng)蛸群體間存在相對(duì)較高的遺傳多樣性。遺傳多樣性和遺傳變異等同嗎？<

56、/p><p>　　基于COⅢ基因的57個(gè)個(gè)體檢出9個(gè)單倍型，總?cè)后w單倍型多樣性指數(shù)(Hd)高達(dá)0.802，這種高度豐富的單倍型多樣性比已研究的真蛸(Octopus vulgaris)[23]、曼氏無(wú)針烏賊(Sepiella maindroni)[24]、魷魚(yú)(Thysano-teuthis rhombus)[25]、鸚鵡螺(Nautilus pompili-us)[26] 等部分頭足類要高，甚至高于部分海洋魚(yú)類、蝦蟹

57、類和貝類的多樣性[27~29]?；贑OⅢ的核苷酸多樣性指數(shù)(Pi)為0.045 (COⅢ)，除了廈門群體的COⅢ核苷酸多樣性指數(shù)之外，各群體也均在0.002以上，與多種海洋生物種類處在同一水平[30~31]。由單倍型多樣性指數(shù)(Hd)和核苷酸多樣性指數(shù)(Pi)來(lái)看，相對(duì)較高的遺傳多樣性說(shuō)明我國(guó)長(zhǎng)蛸群體具備較高的生態(tài)適應(yīng)性和進(jìn)化潛能，這為今后我國(guó)長(zhǎng)蛸資源的合理開(kāi)發(fā)和利用奠定了良好的理論基礎(chǔ)。</p><p>　　

58、本文綜合分析COⅢ基因序列多態(tài)性遺傳參數(shù)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)結(jié)果顯示，四個(gè)長(zhǎng)蛸群體不僅呈現(xiàn)較豐富的遺傳多樣性，廈門群體和其他群體間的遺傳分化差異明顯?；贑OⅢ序列分析廈門群體與其它3個(gè)群體的凈遺傳距離高達(dá)0.101-0.102，據(jù)根Nei 等[32]估算，同一物種內(nèi)的地區(qū)種群間D值變動(dòng)在0~0.05之間，亞種間的D值約為0.02~0.20，種間遺傳距離的變幅為0.10~2.00之間，故廈門群體可能已單獨(dú)形成一個(gè)亞種。兩者的AMOVA分析結(jié)果一致，

59、基于COⅢ基因分析顯示在整個(gè)遺傳變異中以群體間變異為主。遺傳分化系數(shù)和基因流參數(shù)顯示，廈門群體與其他群體的遺傳分化極顯著（p﹤0.01），基因流參數(shù)也遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于1。</p><p>　　本文的分析結(jié)果與常抗美等[8~10]基本一致。?？姑赖萚8]在討論自舟山以北的五個(gè)群體之間廣泛的基因交流問(wèn)題上引入了更新世以來(lái)的冰期黃、渤海海平面升降論述，海平面的反復(fù)升降造成黃、渤海長(zhǎng)蛸群體反復(fù)的遷入和遷出，從而與東海部分海域（舟

60、山）的長(zhǎng)蛸群體產(chǎn)生廣泛的基因交流。李煥持相同的觀點(diǎn)。</p><p>　　本文從另一方面展開(kāi)討論，海洋洋流格局的形成可能會(huì)導(dǎo)致長(zhǎng)蛸群體的分化和基因交流。因海洋環(huán)境中缺乏像陸地一樣能阻止生物種群擴(kuò)散和基因交流的有效屏障[33~34]，導(dǎo)致海洋生物類群與陸生生物相比種群結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、基因交流頻繁、遺傳分化相對(duì)匱乏，尤其是具有長(zhǎng)距離運(yùn)動(dòng)能力的海洋生物[35]。但對(duì)營(yíng)低棲穴居生活的長(zhǎng)蛸而言，活動(dòng)時(shí)間和范圍的限制，以及產(chǎn)卵并孵

61、化于洞穴，理論上這些因素阻斷了群體間的正常的基因交流，群體遺傳分化將會(huì)很明顯。但本文的分析結(jié)果卻與此相悖，中國(guó)沿海的四個(gè)長(zhǎng)蛸群體基本分為兩大類群，廈門長(zhǎng)蛸群體獨(dú)立形成一大類群，舟山及其以北的三個(gè)長(zhǎng)蛸群體匯聚成一個(gè)較大的類群。這樣看來(lái)，舟山及其以北的三個(gè)長(zhǎng)蛸群體形成的第二大類群符合Ward和Stabile的理論，而廈門和其他群體的分化卻又與長(zhǎng)蛸的生活習(xí)性對(duì)種群結(jié)構(gòu)的影響相一致。</p><p>　　作為生活在海洋里

62、的生物長(zhǎng)蛸，具有短距離的生殖和越冬洄游習(xí)性[36]，它們的生存和種族延續(xù)必然受到海洋潮流的影響。作為世界海洋第二大暖流的黑潮是影響我國(guó)海域海流的大型洋流，發(fā)源北赤道，緊貼臺(tái)灣東部進(jìn)入東海，在琉球群島附近形成一分支經(jīng)濟(jì)州島進(jìn)入中國(guó)的黃海和渤海，這支黃海暖流到達(dá)渤?？谥率共澈?nèi)形成逆時(shí)針的環(huán)流，出渤海經(jīng)山東半島向南形成黃海沿岸流經(jīng)舟山群島一直到達(dá)南海海域，因它在南下的流動(dòng)中并不完全連續(xù)，故按所在地區(qū)不同而有不同名稱，自北向南有魯北沿岸流、蘇

63、北沿岸流、浙閩沿岸流和廣東沿岸流[37]。</p><p>　　自浙江東南向福建沿岸的浙閩沿岸流經(jīng)過(guò)溫州，與相反流向的臺(tái)灣海峽流以及黑潮自臺(tái)灣的西北流分支在閩東相遇，如圖7[38]。朱大勇等[39]通過(guò)地波雷達(dá)觀測(cè)了臺(tái)灣海峽西南表層海流季節(jié)性變化，2006年的觀測(cè)結(jié)果如圖8所示（6月份數(shù)據(jù)不全），廈門海域的表層流季節(jié)性變化紛繁復(fù)雜，觀察臨近廈門海域的沿岸表層流基本上是周期性環(huán)形流向，表層流和其他海域缺乏交流，形成

64、一個(gè)相對(duì)封閉的環(huán)流格局。</p><p>　　本研究綜合分析渤海、黃海和東海的沿岸流趨向，正好與長(zhǎng)蛸的種群遺傳結(jié)構(gòu)相吻合。盡管長(zhǎng)蛸的生活習(xí)性影響著種群結(jié)構(gòu)，但是本文還是傾向于支持Ward和Stabile的觀點(diǎn)，在黃海暖流的影響下，自渤海向南的黃海沿岸流和東中國(guó)海寒流一直到達(dá)舟山群島，常年的水團(tuán)交流必將加強(qiáng)長(zhǎng)蛸群體之間的基因交流，這樣就可以解釋大連、青島、和舟山3個(gè)長(zhǎng)蛸群體為何能形成一大類群。舟山群島阻擋了由北向南

65、的沿岸流，浙閩沿岸流在閩東就遭遇了北上的臺(tái)灣海峽流和西進(jìn)的黑潮分支流[38]，臺(tái)灣海峽西南部廈門海域的表層流呈現(xiàn)周期性環(huán)形流向[39]，這樣廈門海域與溫州海域不能形成穩(wěn)定的水團(tuán)交流，加上廈門處在半封閉的海灣內(nèi)，更限制了廈門群體和其他群體間的交流，這些證據(jù)從海水交換角度支持廈門長(zhǎng)蛸群體獨(dú)立形成一大類群。</p><p>　　像長(zhǎng)蛸一樣營(yíng)洞穴生活的海洋生物，缺乏長(zhǎng)距離遷徙和洄游能力，人為干預(yù)和海洋環(huán)境的變化便成為影響

66、種群遺傳結(jié)構(gòu)的主導(dǎo)因素。迄今為止沒(méi)有發(fā)現(xiàn)能有效影響長(zhǎng)蛸遺傳結(jié)構(gòu)的任何人為因素，海洋洋流分布格局便成為影響長(zhǎng)蛸群體基因交流的天然屏障，是決定長(zhǎng)蛸種群結(jié)構(gòu)的一大影響因素。</p><p>　　本文的研究結(jié)果對(duì)長(zhǎng)蛸資源的合理開(kāi)發(fā)和利用具有重要啟示。廈門群體和北方三群體的巨大遺傳分化昭示著以后的長(zhǎng)蛸資源開(kāi)發(fā)管理需要因地制宜，區(qū)別對(duì)待。廈門群體的亞種分化可能性很大，但是進(jìn)一步確認(rèn)亞種的分化需要進(jìn)一步的考證與探究。本文涉及的

67、洋流格局的形成導(dǎo)致群體分化的分析方法可能對(duì)今后其他海洋生物的群體遺傳研究有所幫助。</p><p>　　圖8 2006年各月的表層平均流場(chǎng)(右下方標(biāo)注為平均流的優(yōu)勢(shì)流向和平均流速)[39]</p><p>　　Fig 8 The average current speed in the surface layer of every month in 2006</p><

68、p>　　Fig 8 The average current speed in the surface layer of every month in 2006</p><p><b>　　小結(jié)</b></p><p>　　本次畢業(yè)論文設(shè)計(jì)起至?xí)r間為2010年7月10日至2011年5月30日，其中實(shí)驗(yàn)階段截至于2011年3月16日，歷時(shí)8個(gè)月，論文撰寫歷時(shí)2個(gè)半月

69、。本次實(shí)驗(yàn)中，我們開(kāi)創(chuàng)性地利用線粒體DNA COⅢ基因來(lái)研究我國(guó)沿海海域四個(gè)長(zhǎng)蛸野生群體的遺傳多樣性。通過(guò)本次研究，我們得到的結(jié)論是：由于長(zhǎng)蛸的生殖和越冬洄游習(xí)性以及海洋洋流分布格局等的影響，舟山及以北地區(qū)的三個(gè)長(zhǎng)蛸群體之間存在著比較廣泛的基因交流，使得大連、青島、舟山這三個(gè)地區(qū)的長(zhǎng)蛸群體遺傳差異不是非常顯著，它們屬于一大類群；而由于舟山群島阻擋了由北向南的沿岸流等海洋洋流格局的影響，廈門群體與其他三個(gè)群體之間得不到廣泛的基因交流，再加

70、上廈門處在半封閉的海灣內(nèi)，更限制了廈門群體和其他群體間的交流，而且，生物存在遺傳變異的特性，這樣勢(shì)必會(huì)導(dǎo)致廈門群體與其他三個(gè)群體之間的遺傳差異不斷加大，最終使得廈門群體區(qū)別與其他三個(gè)群體而單獨(dú)形成了一個(gè)類群，并使得廈門群體的亞種分化可能性加大。本文的研究結(jié)果對(duì)長(zhǎng)蛸資源的合理開(kāi)發(fā)和利用具有重要啟示。廈門群體和北方三群體的巨大遺傳分化昭示著以后的長(zhǎng)蛸資源開(kāi)發(fā)管理需要因地制宜，區(qū)別對(duì)待。本文涉及的洋流格局的形成導(dǎo)致群體分</p>

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