生物科學(xué)畢業(yè)論文東海陸架沉積物真核微生物多樣性研究

1、<p><b>　　本科畢業(yè)論文</b></p><p><b>　　（20 屆）</b></p><p>　　東海陸架沉積物真核微生物多樣性研究</p><p>　　所在學(xué)院 </p><p>　　專業(yè)班級 生物

2、科學(xué) </p><p>　　學(xué)生姓名 學(xué)號 </p><p>　　指導(dǎo)教師 職稱 </p><p>　　完成日期 年 月 </p><p><b>　　目錄</b>&

3、lt;/p><p>　　摘要錯(cuò)誤!未定義書簽。</p><p>　　Abstract錯(cuò)誤!未定義書簽。</p><p><b>　　引言1</b></p><p><b>　　1材料與方法3</b></p><p><b>　　1.1材料3</b&g

4、t;</p><p>　　1.1.1樣品3</p><p>　　1.1.2儀器3</p><p>　　1.1.3配置溶液3</p><p>　　1.1.4生化試劑4</p><p>　　1.2實(shí)驗(yàn)方法4</p><p>　　1.2.1樣品的前處理與保藏4</p>

5、;<p>　　1.2.2沉積物樣品總DNA的提取4</p><p>　　1.2.3沉積物總DNA的電泳檢測6</p><p>　　1.2.4PCR擴(kuò)增6</p><p>　　1.2.5PCR產(chǎn)物的純化6</p><p>　　1.2.6真核微生物18S rDNA基因克隆文庫的構(gòu)建7</p><

6、;p>　　1.2.7系統(tǒng)發(fā)育分析8</p><p>　　2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析9</p><p>　　2.1DNA的提取、純化和PCR擴(kuò)增9</p><p>　　2.2克隆文庫的構(gòu)建及測序9</p><p>　　2.3沉積物中真核生物多樣性及系統(tǒng)發(fā)育分析10</p><p>　　2.3.1沉積物中

7、真核微生物多樣性10</p><p>　　2.3.2系統(tǒng)發(fā)育分析12</p><p><b>　　3討論19</b></p><p>　　3.1真核微生物群落多樣性分析19</p><p>　　3.218S rDNA分析群落多樣性實(shí)驗(yàn)優(yōu)化19</p><p><b>　

8、　參考文獻(xiàn)22</b></p><p>　　附錄…………………………………………………………………………...……………. 21</p><p>　　附譯文：中國亞熱帶大型淺水湖-太湖中真核微生物群落組成的季節(jié)變化規(guī)律25</p><p>　　譯文原文…………………………………………………………………………………….42</p><

9、;p>　　致謝…………...………………………………………………………………………… ….54</p><p><b>　　摘要</b></p><p>　　[摘要] 沉積物是集化學(xué)物質(zhì)和微生物于一體的特殊生態(tài)環(huán)境。沉積物中的真核微生物種類繁多、數(shù)量龐大，研究沉積物中真核微生物的多樣性有利于我們更好地了解海洋生態(tài)環(huán)境和海洋演變歷史。本論文通過對東海陸架沉積物1

10、3號地的4個(gè)不同層次的海底泥樣沉積物樣品進(jìn)行研究,采用18S rDNA技術(shù)等手段，對真核生物基因序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)海洋沉積物中有著豐富的真核微生物多樣性，可將它們歸為微藻（Microalgae）、真菌（Fungi）、絲足蟲類（cercozoan）、囊泡類（Alveolate）、后生動(dòng)物（Metazoa）、原生動(dòng)物門（ Protozoa）等六個(gè)類群，其中后生動(dòng)物這一類群是沉積物真核微生物的主要組成部分，各層之間物種數(shù)量沒有明顯

11、的變化規(guī)律，其中10個(gè)克隆子是未知的物種。最后對真核微生物群落多樣性、18S rDNA分析群落多樣性實(shí)驗(yàn)優(yōu)化、海洋微生物多樣性的保護(hù)三個(gè)方面進(jìn)行了討論。 </p><p>　　[關(guān)鍵詞] 東海陸架；沉積物；真核微生物；多樣性；18S rDNA;</p><p><b>　　Abstract</b></p><p>　　[Abstract] S

12、ediment is the special ecological environment,which takes chemical substances and microorganisms into one set. The type of eukaryotic microorganisms from Sediment are vareties as same as the number. With the investigatio

13、n on the diversity of eukaryotic microorganisms,We can better understand the evolution of the marine environment and maritime history. Based on the East China Sea shelf sediments 13 site and the detection of18S rDNA tech

14、niques .we can get the corresponding integration</p><p><b>　　引言</b></p><p>　　作為地球的藍(lán)色土地，海洋共有三億六千萬平方公里的面積，占地球總面積的70.8%,含十四億立方公里的水,占地球水資源的90%。同時(shí)，海洋又是自然資源的寶庫，礦產(chǎn)及營養(yǎng)的大儲(chǔ)藏庫,地球上氧氣大部分都在海洋產(chǎn)生，而且

15、對全球的氣象環(huán)境影響重大。因此海洋作為生態(tài)系統(tǒng)的重要成員，其生態(tài)地位是無可取代的[1]。</p><p>　　地球作為太陽系中唯一一顆有生命的行星，其最初的生命是由海洋孕育的。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，海洋環(huán)境中生存的生物大約有20多萬種，更令人驚奇的是，海洋里總生物量名第一的生物不是魚蝦，而是微型生物，海洋生物量的90%屬于微型生物；如果論個(gè)體，數(shù)量最多的“生物體”是病毒，每1毫升海水中有上百萬個(gè)病毒，個(gè)體數(shù)量占了大洋中有

16、核酸顆粒的94%[2]。</p><p>　　沉積物是集化學(xué)物質(zhì)和微生物于一體的特殊生態(tài)環(huán)境[3]。在漫長的海洋歷史演變過程中，由于海流、陸地河流、人類活動(dòng)、地球地質(zhì)板塊運(yùn)動(dòng)所帶來的海洋地貌的變化，使海底沉積物成為了海洋歷史的記錄者。海洋沉積物是地球上最大面積的覆蓋層, 約為3.5×108 km2 ,占覆蓋地球面積的48.6%[4]。豐富的海洋微生物資源開發(fā)及應(yīng)用前景廣闊, 吸引了世界各國和組織的大量財(cái)

17、力和物力的投入到海洋生物多樣性的研究中來。據(jù)越來越多的研究表明，海底沉積物中蘊(yùn)含著豐富的微生物資源。同時(shí)，海底特殊的高壓、低溫（或高溫）、低光照等理化因素給微生物創(chuàng)造了復(fù)雜且卻獨(dú)特的生存環(huán)境，也給研究者帶來了難度。研究沉積物中的微生物多樣性,有利于我們了解上層覆水的水質(zhì)及變化情況，從而推測其受污染程度，為海洋環(huán)境保護(hù)提供便捷。沉積物中微生物物種、基因等資源的鑒定和獲得,有利于我們了解并增加對當(dāng)前微生物資源的認(rèn)知程度,并為其在生物技術(shù)領(lǐng)域

18、的應(yīng)用奠定基礎(chǔ) [3]。最后，研究沉積物中微生物也是研究海洋化學(xué)循環(huán)的基礎(chǔ)，必將成為未來海洋研究的一個(gè)重要組成部分。</p><p>　　真核微生物是海洋微生物最重要一大類群，它在海洋中廣泛存在,是初級生產(chǎn)力的重要貢獻(xiàn)者,也是微食物環(huán)的重要組成部分。但是，海洋真核微生物的生存方式多種多樣，類群也非常多，以及大多數(shù)真核微生物實(shí)驗(yàn)室的不可培養(yǎng)狀態(tài)，給研究和分類帶來了一定的困難。在現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展中，除去傳統(tǒng)的微生物

19、培養(yǎng)方式，運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)直接對真核微生物種類組成進(jìn)行研究已成為真核微生物多樣性研究的重要方法。這種方法不僅能更多的了解海洋微生物的類群，而且在一定程度上了解海洋微生物的演化及物種的變異進(jìn)化情況，給海洋生態(tài)學(xué)研究帶來了新的曙光。海洋真核微生物分布的研究尚不是很多，因此，對海洋真核微生物的多樣性進(jìn)行研究勢在必行。</p><p>　　本文主要采用18S rDNA分析方法，對一個(gè)采樣點(diǎn)的四個(gè)層次的真核生物多樣性進(jìn)行

20、分析，從而更好的了解東海陸架沉積物的多樣性。</p><p><b>　　材料與方法</b></p><p><b>　　材料</b></p><p><b>　　樣品</b></p><p>　　采自東海陸架沉積物，(見表1.1，)</p><p>　

21、　表1.1 樣品采集位點(diǎn)</p><p>　　Tab1.1 Sampling site</p><p>　　樣品標(biāo)記：0～3cm為131F；3～5cm為132F；5～8cm為133；8～10cm為134F；(注：以下都為此標(biāo)記順序)</p><p><b>　　儀器</b></p><p><b>　　表1.2

22、 主要儀器</b></p><p>　　Tab1.2 List of major equipment</p><p><b>　　配制溶液</b></p><p>　?、臫AE緩沖液：用Tris 242g，冰乙酸 57.1ml，EDTA（0.5mol/l）pH8.0 100ml配置50倍濃度TAE液體后進(jìn)行稀釋使用。</p&g

23、t;<p>　　⑵LB液體培養(yǎng)基、LB固體培養(yǎng)基、LB一Amp培養(yǎng)基（氨芐青霉素至終濃度為120μg/ml）。</p><p>　?、前逼S青霉素溶液10mg/mL。</p><p>　　⑷X-gal貯液（20 mg/mL）、IPTG貯液（20％）。</p><p><b>　　生化試劑</b></p><p&g

24、t;　?、趴侱NA提取試劑盒FastDNA® SPIN Kit for Soil，MP BIO,USA公司。</p><p>　　⑵pMD19- T， dNTP，Taq酶等PCR擴(kuò)增試劑盒，寶生物（大連）有限公司。</p><p>　?、荄L 2000 DNA marker。</p><p>　　⑷瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，天根生化科技有限公司。<

25、/p><p>　　⑸18S rDNA引物，PCR擴(kuò)增引物。</p><p>　?、蔇H5α感受態(tài)細(xì)胞。</p><p><b>　　實(shí)驗(yàn)方法</b></p><p><b>　　樣品的前處理與保藏</b></p><p>　　將采集到的樣品先于-70℃冰箱冷凍保藏。</p&

26、gt;<p>　　分裝時(shí)，待樣品解凍后在超凈工作臺(tái)上分裝，各層泥樣分別裝入5ml EP管2管及10ml EP管1管，分別標(biāo)記131F、132F、133F、134F，分裝結(jié)束后將分裝樣品和原泥樣放回-70℃冰箱中保藏。</p><p>　　沉積物樣品總DNA的提取</p><p>　　在無菌操作下準(zhǔn)確稱取濕重0.5g海底沉積物樣品,采用總DNA提取試劑盒FastDNA®

27、; SPIN Kit for Soil ,按照生產(chǎn)商提供的方法進(jìn)行總DNA的 抽提。</p><p>　　1、在使用試劑盒提取土壤DNA前，要先準(zhǔn)備以下內(nèi)容：</p><p>　　⑴.試劑盒中含有一個(gè)小瓶，是濃縮的SEWS-M洗液，在使用前加入100ml無水乙醇，并在瓶子的表明寫明加入乙醇的時(shí)間，確保瓶子旋緊防止溶液蒸發(fā)，將瓶子中的試劑混勻，室溫保存。</p><p&g

28、t;　?、?在裂解液中加入500mg的土壤樣品，并加入磷酸緩沖液和MT緩沖液，保證管中有250－500ul的空間。如果樣品數(shù)量較多，則分裝到多個(gè)管中。</p><p>　?、?在快速核酸提取儀中，以6.0m/s的速度提取40秒，一般可以將絕大多數(shù)樣品裂解成功，如果實(shí)驗(yàn)需要更長的裂解時(shí)間，樣品最好放在Matrix E管中，置于冰上孵育2分鐘，防止在提取儀中裂解時(shí)間過長所帶來的熱量。</p><p

29、><b>　　2、提取步驟：</b></p><p>　　⑴.將500mg土壤樣品加入Lysing Matrix E裂解管中（見準(zhǔn)備2）。</p><p>　　⑵.加入978ul的磷酸緩沖液Sodium Phosphate Buffer到Lysing Matrix E裂解管中。</p><p>　?、?加入122ul的MT緩沖液。<

30、/p><p>　?、?在快速核酸提取儀中，以6.0m/s的速度對樣品進(jìn)行提取，時(shí)間持續(xù)40秒。</p><p>　?、?14000xg離心5－10分鐘，去除殘片。</p><p>　　（注：離心時(shí)間延長至15分鐘，可以去除大的樣品中多余的殘片，或是有利于從復(fù)雜的細(xì)胞壁中分離細(xì)胞）</p><p>　?、?將上清轉(zhuǎn)移到干凈的2ml離心管中，加250

31、ul PPS（蛋白質(zhì)沉淀液），用手拿住管子上下?lián)u晃10次。</p><p>　?、?14000xg離心5－10分鐘，去除殘片。將上清轉(zhuǎn)移到干凈的15ml離心管中。（注：這一步用2ml的離心管也可以，但是大的管子對DNA混合和附著更為有效）</p><p>　?、?將Binding Matrix溶液混勻，加入1.0 ml Binding Matrix溶液到含上清的15 ml離心管中。<

32、/p><p>　　⑼.將離心管放在漩渦振蕩器上，或者放在手上顛倒搖勻2分鐘；將離心管放在管架上靜置3分鐘，等待硅石沉淀。</p><p>　?、?小心將500ul的上清移除，注意不要碰到附著的顆粒沉淀。</p><p>　?、?在剩下的上清液中將Binding Matrix重懸，將大約600ul的混合液加入SPIN濾膜中，14000xg離心1分鐘，將截留管catch t

33、ube倒空，加入剩下的混合液到SPIN濾膜，重新離心1次，將截留管catch tube再次倒空。</p><p>　?、?加入500ul準(zhǔn)備好的SEWS-M液體，用槍頭吸取液體，輕輕的將小球重懸。（注：確保乙醇已經(jīng)加入SEWS-M濃縮液中）</p><p>　?、?14000xg離心1分鐘，將截留管catch tube倒空，換一個(gè)新的管。</p><p>　?、?不

34、加任何液體，14000xg離心1分鐘，再重復(fù)1次，以便將填料中剩余的溶液甩干。將截留管catch tube倒空，更換管子。</p><p>　?、?將SPIN濾膜放置在空氣中，室溫干燥5分鐘。</p><p>　?、?將附著顆粒（SPIN濾膜上）在50－100ul的DES（除熱源和核酸酶的超純水）中溫和重懸。（注：為避免純化的DNA過度稀釋，請加入能起到重懸作用的最少量的DES；如果在55

35、℃熱快或水浴中孵育5分鐘，可能DNA的產(chǎn)量會(huì)更高）</p><p>　　⒄.14000xg離心1分鐘，將洗脫的DNA轉(zhuǎn)移到干凈的截留管catch tube中，將SPIN濾膜丟棄，DNA可以用于PCR或其他下游實(shí)驗(yàn)使用，－20℃長期保存，或4℃短期保存。</p><p>　　3、將提取的總DNA分別對應(yīng)的標(biāo)上131F、132F、133F、134F。</p><p>　

36、　沉積物總DNA的電泳檢測</p><p>　　將提取的總DNA 用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，以DL2000 DNA Marker作為標(biāo)準(zhǔn)分子量DNA標(biāo)記，經(jīng)核酸染料染色后在紫外凝膠成像系統(tǒng)中觀察并拍照，檢測提取的總DNA是否符合實(shí)驗(yàn)要求。</p><p><b>　　PCR擴(kuò)增</b></p><p>　　1、擴(kuò)增使用的引物為真菌通用引物N

37、S1（5'-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3'）和NS4:（3′-CGGGTAACTCCGTTACAACA -5′）。按表1.3中的反應(yīng)體系進(jìn)行：</p><p>　　表1.3：PCR反應(yīng)體系1</p><p>　　Tab1.3 PCR reaction system 1</p><p>　　2、擴(kuò)增使用T-Gradient PCR儀，反應(yīng)

38、體系基本為95℃預(yù)變性5min， 94℃變性1min；50℃ -60℃的退火溫度50s；72℃延伸2.5min；循環(huán)35次，最后72℃延伸10min。所得的產(chǎn)物用瓊脂凝膠電泳檢測其擴(kuò)增條帶的正確性。</p><p><b>　　PCR產(chǎn)物的純化</b></p><p>　　待上一步電泳檢測確定其擴(kuò)增正確后，將擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠，DL2000 marker標(biāo)記電泳

39、。在紫外凝膠成像系統(tǒng)的操作臺(tái)上，快速將目的片段切下，使用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進(jìn)行膠回收。回收純化的產(chǎn)物可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行。</p><p><b>　　膠回收步驟：</b></p><p>　　⑴柱平衡：向吸附柱CA2（吸附柱放入收集管中）中，加入500μL平衡液BL，12000rpm離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。</p&g

40、t;<p>　?、茖我坏哪康腄NA條帶從瓊脂糖凝膠中切下（盡量切除多余部分），放入干凈的離心管中，稱取重量。（1mg=1μL）</p><p>　?、窍蚰z中加入3倍體積溶膠液PN，50℃水浴10min，其間不斷溫和地上下翻轉(zhuǎn)離心管，以確保膠塊充分溶解。</p><p>　?、燃由喜剿萌芤杭尤胛街鵄2中，室溫放置2min，12000rpm離心1min。倒去廢液，將吸附柱C

41、A2放入收集管中。</p><p>　　⑸向吸附柱CA2中加入600μL漂白液PW，12000rpm離心1min，倒掉廢液，將吸附柱CA2放入收集管中。</p><p>　　⑹向吸附柱CA2中加入600μL漂白液PW，12000rpm離心1min，倒掉廢液。</p><p>　　⑺將吸附柱放回管中，12000rpm離心2min，盡量除盡漂洗液，將吸附柱CA2置于室溫

42、放置數(shù)分鐘，徹底晾干，以防止殘留的漂洗液影響下一步的實(shí)驗(yàn)。將吸附柱放到一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加適量洗脫緩沖液EB，室溫放置2min，12000rpm離心2min，收集DNA溶液，—20℃保存，防止DNA降解。</p><p>　　真核微生物18S rDNA基因克隆文庫的構(gòu)建</p><p><b>　　1、連接反應(yīng)</b></p>&

43、lt;p>　　在冰浴中放置0.2ml EP管，分別加入pMD19- T 載體0.75μL、PCR純化產(chǎn)物4.25μL、SolutionⅠ5μL，16℃低溫水浴鍋中連接過夜。</p><p><b>　　2、質(zhì)粒轉(zhuǎn)化</b></p><p>　?、湃「惺軕B(tài)細(xì)胞DH5α，冰下融解5min，其間將100μL的槍頭在—20℃冰箱里冰凍,預(yù)冷。然后將100μL DH5α加

44、入連接產(chǎn)物中，冰浴30min（其間預(yù)熱水浴鍋，準(zhǔn)備37℃搖床）。</p><p>　?、?2℃熱激60-90s。</p><p>　?、茄杆俜胖帽媳?min，注意冰浴其間勿動(dòng)。</p><p>　?、瘸瑑艄ぷ髋_(tái)上分裝Amp-的LB培養(yǎng)基，每管900μL。</p><p>　?、蓪a(chǎn)物和感受態(tài)細(xì)胞加入Amp-的LB培養(yǎng)基中，37℃ 200r

45、mp搖床培養(yǎng)60min（時(shí)間不宜過長）。</p><p>　?、试谂囵B(yǎng)過程中，超凈工作臺(tái)準(zhǔn)備平板、IPTG、X—gal、涂布棒、酒精燈，可以先加入IPTG（20%）7μL、X—gal（2%）40μL，涂勻，放置30-60min，使平板表面充分吸收。</p><p>　?、藢u床培養(yǎng)的菌液4000rmp離心5min，吸取500μL上清，使菌液富集重懸。</p><p>

46、;　　⑻涂平板（菌液量200μL），并標(biāo)記平板。</p><p>　?、?7℃正置培養(yǎng)1h后，倒置培養(yǎng)過夜12h-16h，具體視菌落生長情況而定。</p><p><b>　　3、克隆文庫的構(gòu)建</b></p><p>　?、懦瑑艄ぷ髋_(tái)打掃干凈，先將1.5ml EP管放在管架上，蓋子打開，槍頭（100μL）、槍、記號筆、滅菌的牙簽、鑷子等用品放

47、在超凈工作臺(tái)上，紫外消毒10-20min，鼓風(fēng)1min。</p><p>　?、泼總€(gè)離心管中加入Amp＋的液體LB培養(yǎng)基800μL。</p><p>　?、怯脺缇囎訆A住牙簽，對克隆進(jìn)行挑取，挑好直接將牙簽放入裝有Amp＋LB液體培養(yǎng)基的離心管中，全部挑完后取出牙簽，蓋好，標(biāo)記。</p><p>　?、?7℃搖床培養(yǎng)3-6h（160-180rmp）。</p&g

48、t;<p><b>　　4、PCR克隆鑒定</b></p><p>　　PCR鑒定克隆的反應(yīng)體系如表1.4所示。</p><p>　　表1.4：PCR反應(yīng)體系2</p><p>　　Tab1.4 PCR reaction system 2</p><p>　　反應(yīng)體系基本為95℃預(yù)變性5min， 94℃變性

49、50s；55℃退火溫度30s；72℃延伸1min；循環(huán)35次，最后72℃延伸10min。所得的產(chǎn)物用瓊脂凝膠電泳檢測確定是否為成功插入目的片段的重組子后，將含有合適片段大小的菌株送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司測序。</p><p><b>　　系統(tǒng)發(fā)育分析</b></p><p>　　測序獲得的18S rDNA 序列上網(wǎng)進(jìn)行BLAST 比對(http://www. n

50、cbi . gov) , 每條序列與BLAST獲得2 條相似性最高的序列應(yīng)用CLUSTALX1.83 進(jìn)行匹配比對,然后篩選出相似度在95%及以上的序列用Clustalx和MEGA軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。</p><p><b>　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析</b></p><p>　　DNA的提取、純化和PCR擴(kuò)增</p><p>　　從13#的4個(gè)片層沉

51、積物樣品中提取總DNA。使用DL 2000 DNA marker作為標(biāo)記進(jìn)行電泳檢測，結(jié)果顯示4個(gè)位點(diǎn)的樣品中總DNA片段均約在23000bp左右（如圖2.1所示）</p><p>　　圖2.1 13#樣品4個(gè)位點(diǎn)的總DNA電泳條帶</p><p>　　箭頭所指為DL 2000 DNA marker位置。</p><p>　　Fig2.1 The total DNA

52、 electrophoresis4 sites’of sample 13#</p><p>　　Arrow marker（λDNA）2000bp</p><p>　　在用引物NS1（ 5'-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3'）和NS4:（ 3′-CGGGTAACTCCGTTACAACA-5′）對真核生物進(jìn)行擴(kuò)增,經(jīng)溫度梯度PCR擴(kuò)增后，所得的產(chǎn)物用瓊脂凝膠電泳檢測

53、。發(fā)現(xiàn)四個(gè)片層的DNA片段大小大約在1200-1300bp左右。</p><p>　　將擴(kuò)增產(chǎn)物在正確的位置切膠，使用膠回收試劑盒進(jìn)行膠回收純化。電泳檢測后，所得回收的產(chǎn)物直接用于克隆文庫的構(gòu)建。</p><p>　　克隆文庫的構(gòu)建及測序 </p><p>　　回收產(chǎn)物經(jīng)pMD-19T載體連接、轉(zhuǎn)化培養(yǎng)、克隆文庫的構(gòu)建、PCR擴(kuò)增后，用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測發(fā)現(xiàn)

54、出現(xiàn)高低不一的條帶陽性克隆條帶，適當(dāng)選取擴(kuò)增片段大小在1000bp-1300bp的樣品，將樣品菌液送測序公司測序，最終得到菌種序列，用于后續(xù)系統(tǒng)發(fā)育分析。</p><p>　　圖2.2：陽性克隆電泳</p><p>　　Fig2.2 Positive clones electrophoresis figure</p><p>　　沉積物中真核生物多樣性及系統(tǒng)發(fā)育分

55、析</p><p>　　沉積物中真核微生物多樣性</p><p>　　本實(shí)驗(yàn)分別隨機(jī)對131F挑取28個(gè)克隆，132F挑取30個(gè)克隆，133F挑取29個(gè)克隆，134F挑取了27個(gè)克隆送測序公司測序。由于成本及時(shí)間的限制，本實(shí)驗(yàn)只能是在有限的取克隆樣品的基礎(chǔ)上，對東海陸架沉積物13＃樣品的微生物群落做整體水平的評估。雖然如此，根據(jù)Rosenberg等科學(xué)家的觀點(diǎn)，不完全采樣并不影響對微生物群

56、落結(jié)構(gòu)的系統(tǒng)發(fā)育分析[5]。</p><p>　　通過測序及系統(tǒng)發(fā)育分析可得，本次從東海陸架沉積物四個(gè)泥層深度的樣品中所獲得的114條18S rDNA序列，參考以往的中外文獻(xiàn)，根據(jù)海洋真核微生物的特殊性，將這些克隆的相似序列分別屬于歸類到微藻（Microalgae）、真菌（Fungi）、絲足蟲類（cercozoan）、囊泡類（Alveolate）、后生動(dòng)物（Metazoa）、原生動(dòng)物門（ Protozoa）等六個(gè)

57、類群，其他還有一些序列無法確定分類。這些數(shù)據(jù)都表明東海陸架沉積物中存在巨大的真核微生物資源。</p><p>　　通過圖5可以看出，從整體上來講，后生動(dòng)物（Metazoa）由于其豐富的種類在克隆文庫中所占的比例最大，在整個(gè)沉積物的真核微生物群落中屬于大類。在這些后生動(dòng)物的類群中，一些為生活在沉積物中的微型成體，也有一些后生動(dòng)物的幼體，當(dāng)然，也有一些死亡細(xì)胞或組織由于沉降由于沉降作用而存在于沉積物中。</p&

58、gt;<p>　　其次為微藻（Microalgae）和絲足蟲類（cercozoan）。結(jié)合圖6，從各層上來講，各類真核微生物在各層所占的比例不同，差別比較明顯，說明各類真核微生物對不同層的理化環(huán)境適應(yīng)性不同，造成了類群的差異性。參考圖5及圖6，并沒有反映出各類微生物在各個(gè)深度層的規(guī)律性的變化，也從側(cè)面說明了沉積物由于上覆水的覆蓋,生境條件比較特殊,如深海沉積物具有高壓(每下降10m,增加1個(gè)大氣壓)、黑暗、有機(jī)物含量低、鹽

59、度高等特征，給真核微生物群落造就的復(fù)雜的環(huán)境[3]。</p><p>　　圖2.3：真核微生物多樣性柱狀分布圖及各層各類群克隆個(gè)數(shù)</p><p>　　Fig2.3：The columnar distribution about the diversity of eukaryotic microorganisms and the number of clones with each gro

60、up and different layers</p><p>　　圖2.4：各層真核微生物多樣性餅狀分布圖</p><p>　　Fig2.4：Each Layer of pie distribution of microbial diversity</p><p><b>　　系統(tǒng)發(fā)育分析</b></p><p>

61、　　從圖2.6-圖2.9中可以看出，13號地樣品中獲得的序列與與從NCBI中找到的相似度95%以上的序列能夠穿插在一起，且基本上是按照一個(gè)克隆序列與一個(gè)相對應(yīng)的序列處于同一分支上，說明沉積物中真核微生物物種的豐富性。其他，例如131F19與131F22（圖2.6）聚集在樹的一處分支上，是由于它們的最相近序列是同一個(gè)，另外如EU418857與GQ426584（圖2.6）他們聚集在樹的一處分支上，說明它們相對于和相對應(yīng)的克隆子序列比起來，兩

62、者間的序列相似度更高一些。</p><p>　　1、微藻（Microalgae）</p><p>　　微藻，主要指光合自養(yǎng)菌，是一類在陸地、海洋分布廣泛，營養(yǎng)豐富、光合利用度高的自養(yǎng)植物，細(xì)胞代謝產(chǎn)生的多糖、蛋白質(zhì)、色素等，使其在食品、醫(yī)藥、基因工程、液體燃料等領(lǐng)域具有很好的開發(fā)前景。根據(jù)95%的相似度，從東海陸架沉積物獲得的微藻（Microalgae）序列通過比對后，主要可以總結(jié)出一下類

63、群：</p><p>　　（1）多甲藻目(Peridiniales)：多甲藻目屬于甲藻門 (Pyrrophyta)橫裂甲藻綱（Dinophyceae）。橫裂甲藻綱是甲藻門最主要分支。運(yùn)動(dòng)細(xì)胞有縱溝和橫溝，兩根鞭毛分別生于腹面縱橫兩溝的相交點(diǎn)附近，一條繞于橫溝，一條自縱溝伸向體后，藻體可借助鞭毛運(yùn)動(dòng)旋轉(zhuǎn)前進(jìn)。多甲藻是最常見的海洋浮游甲藻之一，在海水生態(tài)系統(tǒng)中分布廣泛，但其中的淡水藻種較少[6]。本文中6個(gè)克隆和He

64、terocapsa triquetra序列相似，另有2個(gè)克隆和Heterocapsa sp. HE04序列相似。</p><p>　?。?）中心硅藻綱（Centriae）：中心硅藻綱是硅藻門(Bacillariophyta)下的一個(gè)屬。硅藻的生活方式為單細(xì)胞生活或借助膠質(zhì)連成群體生活。細(xì)胞具有特殊的殼壁，殼壁主要成分是由果膠質(zhì)和硅質(zhì)組成。殼壁由兩瓣套合，分為上、下殼，上殼稍大、下殼較小。殼面有各種花紋。根據(jù)花紋排

65、列，分為中心綱和羽紋綱。其中中心綱細(xì)胞殼面圓形、多角形、橢圓形或不規(guī)則形狀，一般都有輻射對稱花紋，沒有縱溝和擬縱溝，不能運(yùn)動(dòng)，色素體小而數(shù)目多。本文有一個(gè)克隆序列和海鏈藻屬南極海鏈藻（Thalassiosira antarctica）相似度達(dá)99%，且聚為一支，可能為該種。另有一克隆序列和一種未培養(yǎng)中心硅藻綱藻種的比較接近。</p><p>　?。?）亞歷山大藻（Alexandrium）：亞歷山大藻(Alexan

66、drium)是重要的赤潮種類之一，其屬下的20余種甲藻約一半是有毒種類，它們不僅破壞漁業(yè)資源，破壞生態(tài)環(huán)境，而且它們能夠產(chǎn)生PSP貝毒，危害人類健康[7]。亞歷山大藻的歸類一直有爭議存在，一般把它歸在漆溝藻科下的一個(gè)屬。本文中共有一個(gè)克隆序列Alexandrium ostenfeldii，兩個(gè)克隆序列和Alexandrium satoanum相似。</p><p>　?。?）隱藻門（Cryptophyta）：隱藻

67、門有24屬100種左右，少數(shù)是單細(xì)胞，帶有二條鞭毛（葺鞭型、片羽型各一條），具有由四重套膜所包裹的二層類囊體。它們所含的藻膽素為藻藍(lán)素和藻紅素，這二種色素與光化學(xué)系統(tǒng)Ⅱ有關(guān)。隱藻門植物種類不多，但分布很廣，淡水、海水均有分布，隱藻對溫度、光照適應(yīng)性極強(qiáng)，無論夏季和冬季冰下水體均可形成優(yōu)勢種群。本文有一個(gè)克隆序列與隱芽藻（Geminigera cryophila）十分相似。《Nature》雜志在2007年1月25日出版的刊物中一篇關(guān)于對《

68、“紅潮”生物的重新認(rèn)識》的文章中指出：“紅潮”生物Myrionecta rubra以隱芽藻（Geminigera cryophila）為食，并將其細(xì)胞核功能保持30天左右，被用來調(diào)控所偷葉綠體和線粒體。這一被稱為“karyoklepty”的新穎的“細(xì)胞器耕作”方式可能是獲得生物化學(xué)勢的一種強(qiáng)大的演化策略。</p><p>　　（5）另一種藻類：原生藻菌（stramenopile）是一種光合自養(yǎng)藻類，存在于缺氧性的

69、水體或沉積物中。原生藻菌(stramenopile)被認(rèn)為是新的單譜系物種。原生藻菌界(Stramenopila)包括三門：卵菌門(Oomycota)、前毛瓶菌門(Hyphochytriomycota)、網(wǎng)粘菌門(Labyrinthulomycota)。</p><p>　　2、真菌（Fungi）</p><p>　?。?）球囊菌門：真菌菌絲多核,有隔,多數(shù)土生,偶見氣生。某些屬菌絲末端壁

70、加厚形成厚垣孢子,孢子被隔或加厚的孢子壁封閉,也有的被連孢菌絲和孢子腔中的無定形物封閉。目前球囊菌門包含1個(gè)綱:球囊菌綱(Glom-eromycete Cavalier-Smith)。特征與球囊菌門相同[8]。本文的一個(gè)參考序列來自北極泥沙中。</p><p>　?。?）壺菌門（Chytridiomycota）：壺菌門菌物為水生的，腐生在水中的動(dòng)、植物殘?bào)w上或寄生于水生植物、動(dòng)物和其他菌物上，少數(shù)可以寄生高等植物

71、。本文中兩個(gè)參考序列來自日本的Namako-ike鹽水湖，可能在鹽度上與海水比較接近，比較適合壺菌門的菌種生存。</p><p>　　3、絲足蟲類（cercozoan）</p><p>　　絲足蟲類為原生生物的一個(gè)類群，主要包括各種各樣的阿米巴（Amoebae）及鞭毛蟲（flagellates），通常擁有絲狀的假足，在土壤十分常見。本文所獲得的相近序列主要生境有波羅的海冬季的海冰和水體中，

72、挪威的斯瓦爾特群島，海底火山噴口沉積物物（缺氧環(huán)境），深海富含甲烷的沉積物和缺氧性的海洋環(huán)境中都有存在，推測該生物能夠適應(yīng)極端環(huán)境。在總體的群落數(shù)量中，cercozoan占17.5%，屬于優(yōu)勢物種。</p><p>　　4、囊泡類（Alveolate）</p><p>　　囊泡類是囊泡藻界（Chromalveolata）的一大類群。囊泡藻界（Chromalveolata）是一類真核生物，提

73、出者是湯瑪斯·卡弗利爾-史密斯（Thomas Cavalier-Smith），為真核生物中的六大演化支之一，不過尚未正式定為界層級。本文獲得的相近序列主要從東海表層沉積物、深海富含甲烷沉積物及深海冷泉沉積物獲得，其中有兩個(gè)克隆屬于頂器亞門（Aplcomplex）,一個(gè)克隆屬于Marine Alveolata group I [9]。</p><p>　　5、原生動(dòng)物門（Protozoa）<

74、;/p><p>　　通過我們的序列比對，我們還發(fā)現(xiàn)了一些其他的原生動(dòng)物。頂復(fù)動(dòng)物亞門，為最原始、最簡單、最低等的單細(xì)胞動(dòng)物，我們獲得的相近序列分別是未培養(yǎng)的盤蜷綱物種和孢子綱真簇蟲目物種。腰鞭毛蟲屬于腰鞭毛目的原生動(dòng)物,它是一種海生單細(xì)胞生物，有明顯的縱溝和橫溝，橫溝上部稱上錐或上殼，下部稱下錐或下殼。一些腰鞭毛蟲被列為蟲黃藻，另外，一些大數(shù)量腰鞭毛蟲可使海水變得紅色，即所謂的 “赤潮。</p><

75、;p>　　6、后生動(dòng)物（Metazoa）</p><p>　　動(dòng)物界除原生動(dòng)物門以外的所有多細(xì)胞動(dòng)物門類的總稱。帚蟲動(dòng)物門三葉幼蟲（Phoronis sp. KH-2011）環(huán)節(jié)動(dòng)物門的沙蠶（Nephtys）是其中的優(yōu)勢物種。但是三葉幼蟲的序列相似度比較低，克隆序列分別和四種沙蠶序列比較接近（99%-100%）。另外還有扁形動(dòng)物門渦蟲綱的一個(gè)物種。</p><p>　　圖2.6： 基

76、于18S rDNA序列的東海陸架古菌多樣性系統(tǒng)發(fā)育分析(131F)</p><p>　　Fig. 2.6　Phylogenetic analysis of the East China Sea archaeal diversity based on 18S rDNA sequen（131F）</p><p>　　圖2.7：基于18S rDNA序列的東海陸架古菌多樣性系統(tǒng)發(fā)育分析（132F）

77、</p><p>　　Fig. 2.7　Phylogenetic analysis of the East China Sea archaeal diversity based on 18S rDNA sequen(132F)</p><p>　　圖2.8：基于18S rDNA序列的東海陸架古菌多樣性系統(tǒng)發(fā)育分析（133F）</p><p>　　Fig. 2.8　P

78、hylogenetic analysis of the East China Sea archaeal diversity based on 18S rDNA sequen(133F)</p><p>　　圖2.9：基于18S rDNA序列的東海陸架古菌多樣性系統(tǒng)發(fā)育分析（134F）</p><p>　　Fig. 2.9　Phylogenetic analysis of the East

79、China Sea archaeal diversity based on 18S rDNA sequen(134F)</p><p><b>　　討論</b></p><p>　　真核微生物群落多樣性分析</p><p>　　本階段實(shí)驗(yàn)是采用18S rDNA分析方法對東海沉積物的真核微生物多樣性進(jìn)行分析和鑒定。通過序列比對后，發(fā)現(xiàn)微藻（Mic

80、roalgae）、真菌（Fungi）、絲足蟲類（cercozoan）、囊泡類（Alveolate）、后生動(dòng)物（Metazoa）、原生動(dòng)物門（ Protozoa）等六個(gè)類群比例差異比較大，后生動(dòng)物所占的比重最大，而真菌所占的比重最小。后生動(dòng)物主要包括帚蟲動(dòng)物門、環(huán)節(jié)動(dòng)物門、扁形動(dòng)物門、線蟲動(dòng)物門等門類，涉及的物種比較豐富。其中沙蠶屬于其中的優(yōu)勢種，測得的序列和對比序列相似度很高，能達(dá)到99%-100%。測得的真菌主要有兩大類：壺菌門(Ch

81、ytridiomycota)和球囊菌門(Glomeromycota)。壺菌門(Chytridiomycota)屬于低等的海洋真菌，低等的海洋真菌在海洋環(huán)境中很常見,但只有極少數(shù)幾個(gè)種被研究，如文中的都屬于未培養(yǎng)的海洋真菌。它們是多種海洋無脊椎動(dòng)物、海草、藻類的著名寄生菌。真菌是海洋環(huán)境中的嚴(yán)重致病菌。盡管許多可培養(yǎng),并且表現(xiàn)出可能是新次級代謝產(chǎn)物的資源,但尚未作為天然產(chǎn)物產(chǎn)生菌而廣泛研究[10]。在未確定的菌株中，有兩個(gè)個(gè)克隆序列和渦鞭

82、毛</p><p>　　由于測序的成本比較昂貴，本實(shí)驗(yàn)只能從每次克隆中隨機(jī)挑取一定個(gè)數(shù)送測，結(jié)果可能與真實(shí)的群落多樣性存在一定的偏差。本實(shí)驗(yàn)在構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育時(shí)采用95%及以上的相似度篩選克隆序列，可能會(huì)使最后的結(jié)果產(chǎn)生一定的偏差，但更有效的保證了系統(tǒng)發(fā)育類型的有效性和真實(shí)性，使實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)更加科學(xué)。</p><p>　　18S rDNA分析群落多樣性實(shí)驗(yàn)優(yōu)化</p><p&g

83、t;　　1、特異性引物的選擇</p><p>　　本次研究選擇了真核生物通用引物 基因的通用引物NS1（5'-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3'）和NS4:（3′-CGGGTAACTCCGTTACAACA -5′）, 這一對引物可以擴(kuò)增出絕大多數(shù)真核生物的核糖體基因的全序列。但是，由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可得，該引物對真菌的特異性擴(kuò)增比較差，體現(xiàn)了引物的偏好性，對實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生了一定的影響。實(shí)驗(yàn)中，我們可以

84、采用多對引物相結(jié)合分析的方法進(jìn)行分析，例如另外的真核微生物通用引物用ITS（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）或EF3 （5'-TCCTCTAAATGACCAAGTTTG-3'和EF4（5'-GGAAGGGRTGTATTTATTAG-3'）從而可以確定各引物的偏好性，整個(gè)群落多樣性會(huì)會(huì)更加真

85、實(shí)完整。</p><p>　　2、多種分子生物學(xué)方法結(jié)合分析</p><p>　　本實(shí)驗(yàn)只采用了PCR及構(gòu)建克隆文庫的方法來分析真核微生物群落多樣性，雖然PCR有許多優(yōu)點(diǎn)，但是單一的方法也不可避免的將PCR的方法暴露出來。具體表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：（1）擴(kuò)增效率的差異。采用真核微生物通用引物、以提取的混合D N A為模板，擴(kuò)增18S rDNA時(shí)，其擴(kuò)增幾率不均等，而是存在基因優(yōu)先擴(kuò)增現(xiàn)象，即

86、所謂的基因擴(kuò)增偏嗜性。我們也曾用EF3、EF4作為引物進(jìn)行擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)EF3、EF4更有利于海洋真菌的擴(kuò)增[17]。（2）DNA聚合酶的影響。目前用于PCR反應(yīng)中的DNA聚合酶有多種，性質(zhì)差異很大。DNA聚合酶的質(zhì)量和保真性對擴(kuò)增產(chǎn)物產(chǎn)生較大影響。本實(shí)驗(yàn)過程中，實(shí)驗(yàn)中期，我們在樣品靶基因的PCR擴(kuò)增的過程中一直失敗，將寶生物公司的rTaq酶換成天根公司的rTaq酶，結(jié)果取得了部分樣品的擴(kuò)增成功，但是，rTaq酶的保真性有待考證。實(shí)驗(yàn)中后期

87、，我們也采用過降落PCR技術(shù)，在一定程度上能增加引物對模板的識別特異性，降低基因擴(kuò)增的偏嗜性。此外，選用多對引物同時(shí)對混合DNA進(jìn)行PCR分析也能補(bǔ)救擴(kuò)增偏嗜性造成的偏差，提高群落分析的準(zhǔn)確性和科學(xué)性。</p><p>　　為了將它的缺點(diǎn)降到最低，我們可以采用PCR-DGGE的方法。（DGGE）變性梯度凝膠電泳的原理是使用一對特異性引物擴(kuò)增微生物自然群體的18S rRNA基因，產(chǎn)生長度但序列有異的DNA片段的混合

88、物，然后用DGGE分物混合物[11]。PCR-DGGE目前已在微生物分子生態(tài)學(xué)上廣泛利用，尤其在環(huán)境因子對微生物時(shí)空分布的影響方面。其他一些采用多種技術(shù)分析微生物群落多樣性的技術(shù)也很多，在此不再做陳述。合理地采用多種技術(shù)分析真核微生物群落多樣性能夠降低各種獨(dú)立方法的缺陷對實(shí)驗(yàn)的影響，一些合理的搭配也能降低實(shí)驗(yàn)成本。</p><p>　　海洋微生物多樣性的保護(hù)</p><p>　　由于海洋微

89、生物自身的特點(diǎn),以及大部分海洋微生物與人們的生活極小的關(guān)聯(lián)性，造成人類對海洋微生物多樣性認(rèn)識的不足,一直以來,海洋微生物的保護(hù)很少受到人們的注意。到目前為止,除專利菌種外,尚未見到關(guān)于海洋微生物資源保護(hù)的專門法規(guī)。事實(shí)上, 海洋微生物多樣性是生物多樣性的重要組成部分,是人類賴以生存和發(fā)展的基礎(chǔ),在地球物質(zhì)循環(huán)、能量轉(zhuǎn)換和環(huán)境保護(hù)等方面均發(fā)揮著重要的作用。海洋微生物多樣性的喪失不僅會(huì)影響到海洋動(dòng)植物的生長,乃至死亡,還會(huì)導(dǎo)致海洋生態(tài)系統(tǒng)的

90、物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)的失調(diào)[18]。此外，從此次樣品中獲得的序列和從NCBI下載下來最相近的序列的物種生境相比較（附錄一、附錄二），我們會(huì)發(fā)現(xiàn)生境的多樣性能給我們帶來許多訊息。例如：一些微生物的生境是富含甲烷沉積物，我們就可以推斷此處是否有一些可燃冰能源，從而為能源勘測帶來方便；生命是簡單到復(fù)雜，由海洋到陸地，海洋中的微生物資源能為我們提供更多更準(zhǔn)確的生命演化資料；另外，一些微生物的分布情況可以為研究地殼運(yùn)動(dòng)提供有參考意義的資料。<

91、/p><p>　　因而對海洋微生物多樣性保護(hù)一刻也不容忽視，今后,應(yīng)該加強(qiáng)對海洋微生物多樣性的基礎(chǔ)性和綜合性的研究,我們才能更好地實(shí)現(xiàn)保護(hù)的目的,才能有機(jī)會(huì)了解到最大的物種豐富度，也為人類開發(fā)和利用海洋微生物資源提供借鑒和參考資料。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)</b></p><p>　　[1] 孫佳.大西洋、太平洋和印度洋微生物數(shù)量、生

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100、p>　　附錄一: 東海陸架上層沉積物中真核微生物18S rDNA克隆子的親緣關(guān)系</p><p>　　appendix 1： Summary of eukaryotic microorganisms 18S rDNA clone sequence from the 0-10cm sediment sample of east sea</p><p>　　附錄二：未分級序列比照表<