南極中山站沉積物中微生物多樣性分析及宏基因組文庫(kù)研究.pdf

1、微生物在南極的生態(tài)系統(tǒng)中扮演著重要的角色，微生物生態(tài)可較敏銳地反映整個(gè)南極生態(tài)系統(tǒng)的變化。同時(shí)，南極所具有獨(dú)特的地理及氣候特征，造就了極地微生物特殊的生理特征和適應(yīng)機(jī)制。因此南極微生物不但在南極的生態(tài)系統(tǒng)及物質(zhì)的生物地球化學(xué)循環(huán)中扮演了重要角色，在基礎(chǔ)研究和開(kāi)發(fā)應(yīng)用方面也具有廣闊的前景。南極中山站排污入?？诔练e物環(huán)境是受人類(lèi)影響較大的區(qū)域之一，外來(lái)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的引入不僅使該環(huán)境中的微生物群落發(fā)生變化，而且可能刺激“土著”微生物的次級(jí)代謝，產(chǎn)

2、生新的特殊活性物質(zhì)。 本文首先通過(guò)DGGE技術(shù)對(duì)南極中山站排污入海口(ZSS)及其周?chē)?00米近岸(ZSN)沉積物樣品中細(xì)菌和古菌微生物群落結(jié)構(gòu)及其多樣性進(jìn)行了調(diào)查，結(jié)果表明所調(diào)查區(qū)域存在非常豐富的微生物資源。在這兩個(gè)位點(diǎn)檢測(cè)到了比以往關(guān)于南極微生物報(bào)道的更豐富的細(xì)菌類(lèi)群：α-，β-，γ-，δ-，ε-變形細(xì)菌群(α-，β-，γ-，δ-，ε-Proteobacteria)，噬纖維菌-黃桿菌-擬桿菌群(Cytophaga/Flavo

3、bacterium of Bacteroidetes，CFB group)，放線(xiàn)菌群(Actinobacteria)，芽單胞菌群(Gemmatimonadetes)，革蘭氏陽(yáng)性菌(Gram positive group)，綠屈撓菌群(Chloroflexi)，浮霉?fàn)罹?Planctomycete)，酸桿菌群(Acidobacteria)和一個(gè)未知類(lèi)群。并且分析表明，來(lái)自于排污入?？诘募?xì)菌多樣性較周?chē)貐^(qū)更為豐富。同時(shí)在所調(diào)查樣品中也檢

4、測(cè)到了廣生古菌界(Euryarchaeota)的4個(gè)類(lèi)群和泉古菌界(Crenarchaeota)的1個(gè)類(lèi)群，但分析表明在古菌方面，ZSS環(huán)境樣品較為單一，主要集中在廣生古菌界(Euryarchaeota)3個(gè)產(chǎn)烷微生物類(lèi)群，并且所檢測(cè)的古菌序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中已知序列的同源性較低。 其次，本文采用宏基因組技術(shù)，通過(guò)構(gòu)建環(huán)境樣品PKSI-KS和NRPS-A功能基因克隆文庫(kù)，應(yīng)用分子生物學(xué)方法，開(kāi)展了南極ZSS和ZSN樣品中與次級(jí)代謝產(chǎn)物

5、相關(guān)基因(簇)的微生物功能基因多樣性研究，并對(duì)功能基因類(lèi)型及其可能所歸屬的微生物群落進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，在KS基因方面，來(lái)自?xún)蓚€(gè)樣品的所有31個(gè)序列(ZSS，14；ZSN，17)屬于多樣的細(xì)菌類(lèi)群，包括變形細(xì)菌(Proteobacteria)，革蘭氏陽(yáng)性菌(low G+C gram positive bacteria)，浮霉?fàn)罹鷮?Planctomycetes)，藍(lán)細(xì)菌/藍(lán)藻(Cyanobacteria)，放線(xiàn)菌屬(Actinobac

6、teria)，和未/無(wú)法培養(yǎng)的海綿共生菌(uncultured sponge marine-associated microorganisms)。并且有5個(gè)基因類(lèi)型在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上無(wú)法歸屬于已知的類(lèi)群而形成獨(dú)立的分支。同時(shí)，系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)還顯示出一個(gè)區(qū)別于以往所報(bào)道的雜合型PKS/NRPS基因類(lèi)型(hybrid PKS/NRPS enzyme complexes)。在A(yíng)基因方面，所獲得31個(gè)序列(ZSS，13；ZSN，18)主要集中在藍(lán)細(xì)菌/

7、藍(lán)藻(Cyanobacteria)和變形細(xì)菌類(lèi)群(Proteobacteria)。本研究中幾乎所有氨基酸序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中最接近的已知序列同源性較低(KS，<80％；A，<60％)，表明南極環(huán)境中可能蘊(yùn)含著豐富的與次級(jí)代謝產(chǎn)物相關(guān)的基因，并且有可能發(fā)現(xiàn)新的獨(dú)特的由微生物產(chǎn)生的天然產(chǎn)物。 第三，本文構(gòu)建了南極中山站排污入海口沉積物中微生物ZS cosmid宏基因組文庫(kù)，獲得了約6500個(gè)陽(yáng)性克隆，推算該文庫(kù)至少包含了22

8、8Mb南極環(huán)境樣品DNA，可以覆蓋約10株類(lèi)似E.coli菌株的總基因組。采用PCR擴(kuò)增和菌落原位雜交，定位到了4個(gè)與次級(jí)代謝產(chǎn)物相關(guān)基因的克隆，對(duì)其中一個(gè)具有潛在A(yíng)基因的克隆(ZSK-90)進(jìn)行了基因組測(cè)序，插入片段全長(zhǎng)41，263bp。從中獲得了一完整的非核糖體多肽合成酶(NRPSs)基因簇，長(zhǎng)約11kb，這是國(guó)內(nèi)首次從南極環(huán)境樣品宏基因組文庫(kù)中篩選到的與次級(jí)代謝產(chǎn)物相關(guān)的基因簇，本研究對(duì)其基因類(lèi)型，保守序列等方面進(jìn)行了初步分析，推

9、測(cè)該酶基因簇第一組件腺苷化結(jié)構(gòu)域(A)可能特定的活化纈氨酸(Val)。由于所獲得的序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中已知序列同源性較低(<43％)，推測(cè)可能產(chǎn)生目前尚未發(fā)現(xiàn)的新型化合物結(jié)及其代謝途徑。 第四，本文首次運(yùn)用DDRT法與環(huán)境樣品宏基因組文庫(kù)相結(jié)合，從該文庫(kù)得到了約10個(gè)作用于DNA具潛在抗腫瘤活性的克隆子，采用MTT法對(duì)其中活性較高的克隆子進(jìn)行細(xì)胞毒活性測(cè)定，表明克隆子ZSE-3對(duì)卵巢癌細(xì)胞的抑瘤率達(dá)55％，同時(shí)該克隆對(duì)金黃色葡萄球菌，

10、枯草芽孢桿菌和白假絲酵母顯示出拮抗活性。目前，對(duì)ZSE-3活性物質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了初步研究。本研究還通過(guò)功能平板從該宏基因組文庫(kù)中篩選到了部分具有蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纖維素酶活性的陽(yáng)性克隆，并且獲得了一株能在堿性pH13條件下產(chǎn)生蛋白酶活性的克隆。 我們所構(gòu)建的宏基因組Cosmid文庫(kù)包含了豐富的微生物基因組，克服了傳統(tǒng)培養(yǎng)方法的局限性，獲得了豐富的極地微生物遺傳信息；而且其中包含的微生物絕大多數(shù)是尚未培養(yǎng)或鑒定的新的菌群或菌種，