蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能

1、生物化學Biochemistry山東大學醫(yī)學院生物化學與分子生物學系田克立Tel: 13791087728E-mail: tiankeli@sdu.edu.cnSpring 2014,1. 小分子 H2O（＞50%） metal irons: Na+, K+, Cl-, Ca2+, P- …. trace element : Fe2+, Zn2+, Mg2+ ….. car

2、bohydrates (糖類) lipids (脂類) amino acids (氨基酸) vitamins (維生素類) and others2. 生物大分子 proteins（蛋白質(zhì)）(enzyme，酶) nucleic acids（核酸): DNA and RNA polysaccharides (多糖) glycoproteins (糖蛋白, 糖

3、+蛋白質(zhì)) proteoglycan (蛋白聚糖) lipoproteins (脂蛋白, 脂+蛋白質(zhì)) nucleoproteins (核蛋白, 核酸+蛋白質(zhì)),構(gòu)成生物體的生物分子,蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能,第 一 章,Structure and Function of Proteins,蛋白質(zhì)(protein)是由許多氨基酸(amino acids)通過肽鍵相連形成的高分子含氮化合物。 蛋白質(zhì)是生物 體重

4、要組成成分：分布廣，含量高：蛋白質(zhì)是細胞內(nèi)最豐富的有機分子，占人體干重的45％，某些組織含量更高，例如脾、肺及橫紋肌等高達80％。 蛋白質(zhì)具有重要的生物學功能作為生物催化劑（酶），代謝調(diào)節(jié)作用，免疫保護作用，凝血抗凝血，物質(zhì)的轉(zhuǎn)運和存儲，運動與支持作用，參與細胞間信息傳遞，氧化供能等。,第一節(jié) 蛋白質(zhì)的分子組成,,蛋白質(zhì)的元素組成 C (50~55%), H (6~7%), O (19~24%), N (

5、13~19%), S (0~4%), P, metal elements,Ⅰ…蛋白質(zhì)元素組成的特點 * 各種蛋白質(zhì)的含氮量很接近，平均為16％。 * 體內(nèi)的含氮物質(zhì)主要為蛋白質(zhì)，測定生物樣品中的含氮量，根據(jù)以下公式可推算出蛋白質(zhì)的大致含量： 100克樣品中蛋白質(zhì)的含量 ( g % ) = 每克樣品含氮克數(shù)× 6.25×100,一. 蛋白質(zhì)的分子組成 —— 氨基酸（amino

6、acids）是組成蛋白質(zhì)的基本單位,存在自然界中的氨基酸有300余種，但組成人體蛋白質(zhì)的氨基酸僅有20種，且均屬 L-α-氨基酸（甘氨酸除外）。 其他重要的氨基酸 (如鳥氨酸,瓜氨酸,β-丙氨酸等),α,Name,Three-letter Symbol,and One-letter Symbol,丙氨酸 精氨酸天冬酰胺 天冬氨酸半胱氨酸谷氨酰胺谷氨酸甘氨酸組氨酸亮氨酸異亮氨酸賴氨酸

7、蛋氨酸苯丙氨酸脯氨酸絲氨酸蘇氨酸色氨酸酪氨酸纈氨酸,,根據(jù)R側(cè)鏈基團的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)不同：非極性脂肪族(疏水性)氨基酸極性中性氨基酸芳香族氨基酸酸性氨基酸堿性氨基酸,二. 氨基酸的分類(Classification of amino acids),,(1) 側(cè)鏈含烴鏈的非極性\疏水性脂肪族氨基酸,非極性氨基酸R基團間可形成疏水作用力,(2) 極性中性氨基酸,(3) 芳香族氨基酸——側(cè)鏈含芳香基團,可吸收紫外光，最大

8、吸收峰280nm,Hydrogen bonds氫鍵,一些功能基團如–OH, -SH, -NH3+,H2O等之間可形成氫鍵,(4) 酸性極性氨基酸----R基團帶負電荷（pH 7.2）,,(5) 堿性極性氨基酸----R基團帶正電荷（pH 7.2）,帶相反電荷的氨基酸R側(cè)鏈基團之間的相互作用,Ionic bonds (salt bonds)離子鍵（鹽鍵）,幾種特殊氨基酸,脯氨酸 Proline（亞氨基酸）,-S-S- 二硫鍵,半胱

9、氨酸, 胱氨酸,Disulfide bond,,胰島素 (Insulin)依賴二硫鍵維持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性,二硫鍵 (Disulfide bond),維持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,蘇氨酸,絲氨酸,酪氨酸,-OH 基的H可被其它化學基團，如磷酸基P取代.,其他分類方式,,,,側(cè)鏈含羥基的氨基酸,蛋氨酸,半胱氨酸,含硫氨基酸,胱氨酸,α–NH2 and α–COOH 可解離： – COOH→COO- + H+ – NH2 + H+→

10、NH3+ R 基團含可解離基團: 酸性和堿性 AAs 氨基酸是兩性電解質(zhì)，其解離程度 取決于所處溶液的酸堿度(pH).,α,三. 氨基酸的理化性質(zhì)(Properties of amino acids),1. 氨基酸具有兩性解離的性質(zhì),pH=pI,pH>pI,pH<pI,氨基酸的兼性離子,陽離子,陰離子,等電點(isoelectric point, pI) 在某一pH的溶液中，氨基酸解離成陽離子

11、和陰離子的趨勢及程度相等，成為兼性離子，分子所帶的凈電荷為零, 呈電中性。此時溶液的pH值稱為該氨基酸的等電點。,pI = ½ (pK1+pK2),寫出電離式,取兼性離子兩邊的pK值的平均值,2. 紫外吸收,色氨酸、酪氨酸的最大吸收峰在 280 nm 附近。 大多數(shù)蛋白質(zhì)含有這兩種氨基酸殘基，所以測定蛋白質(zhì)溶液280nm的光吸收值是分析溶液中蛋白質(zhì)含量的快速簡便的方法。,3. 茚三酮反應(yīng),* 肽鍵(peptide bo

12、nd)是由一個氨基酸的?-羧基與另一個氨基酸的?-氨基脫水縮合而形成的化學鍵。,四. 蛋白質(zhì)是由許多氨基酸殘基組成的多肽鏈,（一）氨基酸通過肽鍵連接形成肽 (peptide),peptide bond or amide bond (酰胺鍵),,+,,,甘氨酰甘氨酸,肽鍵,Peptide 肽,殘基,,,多肽鏈,,* 肽是由氨基酸通過肽鍵縮合而形成的化合物。,,,羧基末端C末端,氨基末端N末端,,Backbone or main-cha

13、in主鏈骨架,,,Side-chain側(cè)鏈,,COO- CH2,CH2,,,NH3+CH2CH2CH2,,,,Peptide 肽,Dipeptide (二肽): two AA residues（2個AA殘基） Tripeptide (三肽): three AA residues Oligopeptide (寡肽): fewer than 10 AA residues Polypeptide (多肽): fewe

14、r than 50 AA residues Protein (蛋白質(zhì)): more than 50 AA residues,Gly-Ala, Ala-Gly Gly-Ala-Lys, Gly-Lys-Ala, Ala-Gly-Lys, Ala-Lys-Gly, Lys-Ala-Gly, Lys-Gly-Ala, (1 x 2 x 3 x 4 x 5……… x n),肽有多種形式,20種氨基

15、酸可排列組合形成種類繁多的蛋白質(zhì),N末端,C末端,牛核糖核酸酶,（二） 重要生物活性肽,1. 谷胱甘肽 (glutathione, GSH),三肽 功能基團：- SH,,GSH過氧化物酶,GSH還原酶,NADPH+H+,NADP+,Antioxidant 2GSH + H2O2 → GSSG + 2 H2O GSSH + NADPH + H+ → 2GSH + NADP,Functions

16、 of GSH,體內(nèi)許多激素屬寡肽或多肽,神經(jīng)肽,2. 多肽類激素及神經(jīng)肽,第二節(jié) 蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)Structure of Proteins,一級結(jié)構(gòu) (primary structure)二級結(jié)構(gòu) (secondary structure)三級結(jié)構(gòu) (tertiary structure)四級結(jié)構(gòu) (quaternary structure),一. 蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)(Primary structure of prote

17、in),從N端至C端以肽鍵相連的氨基酸排列順序，包括二硫鍵的位置。 主要的化學鍵：肽鍵，有些蛋白質(zhì)還包括二硫鍵。,,翻譯,,轉(zhuǎn)錄,蛋白質(zhì)的氨基酸序列是由基因序列決定的,一級結(jié)構(gòu)是蛋白質(zhì)空間構(gòu)象和特異生物學功能的基礎(chǔ),R側(cè)鏈基團的相互作用,二. 蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu) (Secondary structure),蛋白質(zhì)分子中某一段肽鏈的局部空間結(jié)構(gòu)，即該段肽鏈主鏈骨架原子的相對空間位置，并不涉及氨基酸殘基側(cè)鏈的構(gòu)象。主要化學鍵：氫鍵,主鏈

18、骨架,,,肽鍵特性,（一） 肽單元（平面） Peptide unit (plane),,,,,肽單元,參與肽鍵的6個原子C?1、C、O、N、H、C?2位于同一平面，C?1和C?2在平面上所處的位置為反式(trans)構(gòu)型，此同一平面上的6個原子構(gòu)成了肽單元 (peptide unit) 。,與C?1和C?2連接的單鍵可自由旋轉(zhuǎn)，旋轉(zhuǎn)角度決定相鄰肽單元平面的相對空間位置，從而形成不同的二級結(jié)構(gòu)形式。,蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的主要形式,?-螺旋 (

19、 ? -helix ) ?-折疊 ( ?-pleated sheet ) ?-轉(zhuǎn)角 ( ?-turn ) 無規(guī)卷曲 ( random coil ),(二) ?-螺旋 α-helix,right-hand helix,left-hand helix,主鏈骨架形成 右手螺旋,每3.6個氨基酸殘基螺旋上升一圈 螺距 0.54 nm R側(cè)鏈伸向螺旋外側(cè),Model of Right-Handed Alpha-He

20、lix Showing H-Bonding,α－螺旋結(jié)構(gòu),多肽鏈的主鏈圍繞中心軸有規(guī)律的螺旋式上升,螺旋走向為順時鐘,即右手螺旋; 氨基酸側(cè)鏈(R)伸向螺旋外側(cè)。每3.6個氨基酸殘基螺旋上升一圈,螺距為0.54nm;每個肽鍵的N－H和其氨基端第四個肽鍵的羰基氧(O=C)形成氫鍵,氫鍵的方向與螺旋長軸基本平行。肽鏈中的全部肽鍵都可形成氫鍵,以穩(wěn)固α－螺旋結(jié)構(gòu)。肌紅蛋白和血紅蛋白分子中有許多肽鏈段落呈α-螺旋結(jié)構(gòu)。毛發(fā)的角蛋白、肌肉的

21、肌球蛋白以及血凝塊中的纖維蛋白,它們的多肽鏈幾乎全長都卷曲成α－螺旋。雙性α－螺旋,（三）?-折疊（β-pleated sheet）,兩條以上多肽鏈構(gòu)成，多肽鏈充分伸展,每個肽單元以Cα為旋轉(zhuǎn)點,依次折疊如扇面狀；通過肽鏈間的肽鍵羰基氧(O=C)和亞氨基氫形成氫鍵從而穩(wěn)固β－折疊結(jié)構(gòu)。,氨基酸殘基側(cè)鏈(R)交替位于折疊片層上下方,平行肽鏈走向有平行與反平行兩種方式。,β-折疊,兩條以上多肽鏈構(gòu)成，多肽鏈充分伸展,每個肽單元以Cα為旋轉(zhuǎn)

22、點,依次折疊如扇面狀；氨基酸殘基側(cè)鏈(R)交替位于折疊片層上下方；平行肽鏈走向有平行與反平行兩種方式。通過肽鏈間的肽鍵羰基氧(O=C)和亞氨基氫形成氫鍵從而穩(wěn)固β－折疊結(jié)構(gòu)。蠶絲蛋白幾乎都是β－折疊結(jié)構(gòu),許多蛋白質(zhì)既有α-螺旋又有β－折疊。,（四）?-轉(zhuǎn)角(β－turn)和無規(guī)卷曲(random coil),無規(guī)卷曲是用來闡述沒有確定規(guī)律性的那部分肽鏈結(jié)構(gòu)。,* β－轉(zhuǎn)角常發(fā)生于肽鏈進行180°回折時的轉(zhuǎn)角上。* β一

23、轉(zhuǎn)角通常由4個氨基酸殘基組成,其第一個殘基的羰基氧(O=C)與第四個殘基的氨基氫(H)可形成氫鍵。* β－轉(zhuǎn)角的第二個殘基常為脯氨酸,其他常見殘基有甘氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺和色氨酸。,在許多蛋白質(zhì)分子中，可發(fā)現(xiàn)二個或二個以上具有二級結(jié)構(gòu)的肽段，在空間上相互接近，形成一個有規(guī)則的二級結(jié)構(gòu)組合，被稱為超二級結(jié)構(gòu) (super-secondary structures)。 包括：αα，β αβ ， β β等。

24、模體 (motif) 是具有特殊功能的超二級結(jié)構(gòu)。,（五）模體 (motif),Motif (模體),在許多蛋白質(zhì)分子中，可發(fā)現(xiàn)二個或三個具有二級結(jié)構(gòu)的肽段，在空間上相互接近，形成一個特殊的空間構(gòu)象，發(fā)揮特殊功能，被稱為模體(motif)。 一個模體有其特征性的氨基酸序列.,常見模體 motif： α helix－β turn (or loop) –α helix β-α-β Chain -β turn – chain Ch

25、ain -β turn – α helix - β turn – chain等,,鈣結(jié)合蛋白中結(jié)合鈣離子的模體,鋅指結(jié)構(gòu),,有些模體也可僅由幾個氨基酸殘基（而非超二級結(jié)構(gòu)）組成。 e.g. RGD (Arg-Gly-Asp ) motif,（六）氨基酸殘基的側(cè)鏈對二級結(jié)構(gòu)形成的影響,蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)是以一級結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)的。一段肽鏈其氨基酸殘基的側(cè)鏈適合形成?-螺旋或β-折疊，它就會出現(xiàn)相應(yīng)的二級結(jié)構(gòu)。,三、蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)（Terti

26、ary structure）,整條肽鏈中全部氨基酸殘基的相對空間位置。即肽鏈中所有原子在三維空間的排布位置。主要的化學鍵: 疏水作用、鹽鍵、氫鍵和 Van der Waals力等.,結(jié)構(gòu)域（ Domain ）,分子量較大的蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)中?？烧郫B成多個結(jié)構(gòu)較為緊密的區(qū)域，并各行使其功能，稱為結(jié)構(gòu)域。 球狀蛋白質(zhì)的獨立折疊單位，有較獨立的三維結(jié)構(gòu)。如：脂肪酸合酶,有些蛋白質(zhì)分子含有二條或多條多肽鏈，每一條多肽鏈都有完整的三級結(jié)構(gòu)，稱

27、為蛋白質(zhì)的亞基 (subunit)。蛋白質(zhì)分子中各亞基的空間排布及亞基接觸部位的布局和相互作用，稱為蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)。含有四級結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì),單獨的亞基一般沒有生物學功能,只有完整的四級結(jié)構(gòu)寡聚體才有生物學功能。亞基之間的結(jié)合力主要是氫鍵和離子鍵。,四. 蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)（Quaternary structure）,血紅蛋白的四級結(jié)構(gòu),（一）一級結(jié)構(gòu)是空間構(gòu)象的基礎(chǔ),一、蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)是高級結(jié)構(gòu)與功能的基礎(chǔ),第三節(jié) 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功

28、能的關(guān)系,1 peptide chain: 124 AAs4 Disulfide bonds,天然狀態(tài)，有催化活性,尿素、 β-巰基乙醇,,去除尿素、β-巰基乙醇,非折疊狀態(tài)，無活性,,一級結(jié)構(gòu)是蛋白質(zhì)空間構(gòu)象和特異生物學功能的基礎(chǔ)。但不是決定蛋白質(zhì)空間構(gòu)象的唯一因素。 多數(shù)多肽鏈的正確折疊和成熟不能自發(fā)完成，需要分子伴侶的參與。,(二) 一級結(jié)構(gòu)相似的蛋白質(zhì)具有相似的高級結(jié)構(gòu)和功能,Homology (同源性)：由同一基因進化

29、而來的一類蛋白質(zhì)。,,大猩猩,長臂猿,獼猴,鼠,(三) 氨基酸序列提供重要的生物進化信息,關(guān)鍵氨基酸改變,基因突變,蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能改變導致分子病,,,（四）蛋白質(zhì)關(guān)鍵氨基酸序列改變可引起疾病,鐮刀形紅細胞性貧血,這種由蛋白質(zhì)分子發(fā)生變異所導致的疾病，稱為“分子病”。,僅此一個氨基酸之差,使水溶性的血紅蛋白，聚集成絲，相互粘著，紅細胞變形成為鐮刀狀而極易破碎，產(chǎn)生貧血。,Sickle-cell anemia 鐮刀型紅細胞貧血,這種由蛋白質(zhì)

30、分子發(fā)生變異所導致的疾病，稱為“分子病”,Crescent-shaped erythrocytes,(lack of blood),（一）肌紅蛋白亞基與血紅蛋白結(jié)構(gòu)相似,二.蛋白質(zhì)的功能依賴特定空間結(jié)構(gòu),球狀蛋白；含血紅素輔基；均可結(jié)合氧,Myoglobin (Mb) 肌紅蛋白,單肽鏈, 具有三級結(jié)構(gòu),His F8,Hemoglobin (Hb) 血紅蛋白,4個亞基組成, α2β2 (adult)，含4個血紅素輔基 具有四級結(jié)構(gòu),四

31、個亞基之間形成8個鹽鍵,Hb與Mb一樣能可逆地與O2結(jié)合， Hb與O2結(jié)合后稱為氧合Hb。氧合Hb占總Hb的百分數(shù)（稱百分飽和度）隨O2濃度變化而改變。,（二）血紅蛋白亞基構(gòu)象變化可影響亞基與氧結(jié)合,Hb與O2 結(jié)合機制,Mb Hb + + O2 O2MbO2 HbO2O2-飽和度[HbO2] [Hb],,,,,,X 100%,Mb與Hb的O2飽和曲線,Mb

32、: 對O2親和力高，直角雙曲線 Hb: 對O2親和力低，S形曲線,肌紅蛋白(Mb)和血紅蛋白(Hb)的氧解離曲線,Hb緊張態(tài) (T state): 4個亞基緊密結(jié)合，對O2親和力低； Hb松弛態(tài)(R state)：一個亞基結(jié)合O2后，鹽鍵斷裂，可明顯改變Hb其它亞基對O2的親和力。,別構(gòu)效應(yīng)(Allosteric effect),配體分子(O2)與蛋白質(zhì)(Hb亞基)結(jié)合后, 蛋白質(zhì)空間構(gòu)象發(fā)生變化,從而引起功能的變化，稱為別構(gòu)效應(yīng)

33、。 別構(gòu)效應(yīng)劑: 小分子，如，O2,Cooperativity (協(xié)同效應(yīng)),一個寡聚體蛋白質(zhì)的一個亞基與其配體結(jié)合后，能影響此寡聚體中另一個亞基與配體結(jié)合能力的現(xiàn)象，稱為協(xié)同效應(yīng)。 如果是促進作用則稱為正協(xié)同效應(yīng)(positive cooperativity)如果是抑制作用則稱為負協(xié)同效應(yīng)(negative cooperativity),Hb and Mb,Hb：4 亞基，四級結(jié)構(gòu)Mb：1亞基，三級結(jié)構(gòu),Hb: 運輸O2Mb

34、: 儲存O2,空間結(jié)構(gòu),Hb：正協(xié)同效應(yīng)Mb：無協(xié)同效應(yīng),O2 結(jié)合特性,功能,（三）蛋白質(zhì)構(gòu)象改變與疾病,蛋白質(zhì)構(gòu)象疾?。ㄕ郫B?。喝舻鞍踪|(zhì)的折疊發(fā)生錯誤，盡管其一級結(jié)構(gòu)不變，但蛋白質(zhì)的構(gòu)象發(fā)生改變，仍可影響其功能，嚴重時可導致疾病發(fā)生。,蛋白質(zhì)的錯誤折疊可造成致命后果,蛋白質(zhì)構(gòu)象改變導致疾病的機理：有些蛋白質(zhì)錯誤折疊后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉樣纖維沉淀，產(chǎn)生毒性而致病，表現(xiàn)為蛋白質(zhì)淀粉樣纖維沉淀的病理改變。已發(fā)現(xiàn)20多種

35、蛋白，包括Prion蛋白、Aβ等可形成與疾病有關(guān)的淀粉樣沉淀。,多種疾病與蛋白質(zhì)的錯誤折疊相關(guān),神經(jīng)退行性疾病如阿爾茨海默病(AD),帕金森病(PD),亨廷頓舞蹈病(HD),朊蛋白病(prion disease),家族性肌萎縮側(cè)索硬化癥(ALS)等均與錯誤折疊的蛋白質(zhì)聚集并形成淀粉樣纖維沉淀或斑塊有關(guān)。,是由朊病毒蛋白(prion protein, PrP)引起的一組人和動物神經(jīng)退行性病變。表現(xiàn)為進行性癡呆、小腦共濟失調(diào)、肌肉控制減弱、

36、精神敏銳度下降、健忘和失眠等。又稱海綿狀腦病。具有傳染性、遺傳性或散在發(fā)病的特點。動物間的傳播是由朊病毒蛋白（Prion protein, PrP）組成的傳染性顆粒（不含核酸）完成的，是一種蛋白質(zhì)感染因子。,朊蛋白病 (prion disease),Prion蛋白研究揭示生物信息可直接在蛋白質(zhì)間傳遞，改變了生物信息傳遞的傳統(tǒng)觀點。,CJD: Creutzfeld-Jakob disease,學名：克羅伊茨費爾德—雅各布氏癥

37、 簡稱克-雅氏癥（人紋狀體脊髓變性病CJD）俗名：瘋牛病 臨床癥狀 ：出現(xiàn)進行性癡呆或神經(jīng)錯亂，視覺模糊，平衡障礙，肌肉收縮等。 神經(jīng)病理檢查 ：病人的腦神經(jīng)組織發(fā)生海綿狀變性,病羊(羊瘙癢癥)神經(jīng)組織的海綿狀損傷 圖片來自http://www.vetmed.ucdavis.edu,vCJD病人大腦組織切片，左：海綿狀病變及周圍的沉淀斑，右：淀粉樣蛋白沉淀。引自Stanley B. Prusiner 1997,CJD的傳播

38、方式,主要方式為家族遺傳另外還可以傳染：①手術(shù)時接觸受朊病毒污染的器械 ②食用被瘋牛病污染了的牛肉或牛骨髓③移植攜帶CJD的器官,卡里頓·加德賽克,美國國立衛(wèi)生研究院病毒和神經(jīng)研究室主任，因發(fā)現(xiàn)神經(jīng)性傳染性疾病的新病因和傳播新機制而獲得1976年諾貝爾醫(yī)學/生理學獎。,加德賽克在新幾內(nèi)亞島發(fā)現(xiàn)了一種奇怪的疾病 ，當?shù)氐耐林朔Q之為“kuru”。由于找不到病因，被當?shù)厝朔Q為“終極巫術(shù)”。 Kuru在當?shù)氐暮x是

39、顫抖，因某種未知的寒冷或恐懼而顫抖。一旦Kuru的顫抖開始，就不可逆轉(zhuǎn)，詛咒會越來越烈，直至死亡為止。Kuru的詛咒非常殘酷：先是不可抑制的顫抖，然后喪失行走能力及無法言語，接著癱瘓。但中了巫術(shù)的人至死心智都很清醒，不會陷入昏睡狀態(tài)，因此格外痛苦。,經(jīng)過加德賽克對死者腦部的解剖和進一步研究，在大腦的特定區(qū)域會檢查出細微的小孔，使腦組織看起來像一塊海綿。很快就將其與CJD聯(lián)系起來。但是CJD曾經(jīng)一度被認為是一種遺傳病，它是否含有傳染性物質(zhì)

40、呢？ 1968年，加德賽克將死于CJD病人的腦組織提取物注射到正常的實驗動物身上，該動物也會死于與kuru或CJD相似的癥狀。明顯地，這種提取物含有遺傳物質(zhì)，在當時被推測為某種病毒。,史坦利·布魯希納,美國加州大學舊金山分校教授。因其發(fā)現(xiàn)了朊病毒,并在其致病機理的研究方面做出了杰出貢獻，而獲得1997 年諾貝爾生理醫(yī)學獎,朊病毒（Prion):不含核酸，完全由蛋白質(zhì)構(gòu)成的病毒。 最初推測朊

41、病毒是像普通病毒一樣的微粒，只是缺乏核酸。但是實際與預期的相反，朊病毒很快被證明可由細胞自身染色體的基因編碼。這個基因稱為PRNP，該基因位于人第20號染色體的短臂，小鼠第2號染色體。它可以表達于正常的腦組織并且編碼一種命名為PrPc的蛋白質(zhì)，存在于神經(jīng)細胞的表面，對蛋白酶和高溫敏感。PrPc精確的功能至今仍不清楚。但是這種蛋白質(zhì)的變異形式目前在人腦中發(fā)現(xiàn)，這就是CJD。,具有致病作用的是PrPSc蛋白（scrapie-associat

42、ed prion protein） ，是一種結(jié)構(gòu)變異的蛋白質(zhì)，對高溫和蛋白酶均具有較強的抵抗力,具有感染性。它能轉(zhuǎn)變細胞內(nèi)的此類正常的蛋白PrPC，使PrPC發(fā)生結(jié)構(gòu)變異，變?yōu)榫哂兄虏∽饔玫腜rPSc。因此是一種蛋白質(zhì)感染因子。,,Prion的結(jié)構(gòu)模型，左PrPc，右PrPSc  圖片來自http://www.cmpharm.ucsf.edu/cohen/media/pages/gallery.html,PrPSc與PrPc的

43、一級結(jié)構(gòu)相似，均由253-4個氨基酸組成，但PrPc的高級結(jié)構(gòu)中只有極少的β折疊（＜3%），而PrPsc則具有45%的β折疊。動物被感染后，發(fā)生錯誤折疊的PrPSc蛋白堆積在腦組織中，形成不溶的淀粉樣蛋白沉淀，無法被蛋白酶水解，引起神經(jīng)細胞凋亡（Apoptosis），,PrPc與 PrPSc的比較,第四節(jié),蛋白質(zhì)的理化性質(zhì),,,,NH3+ COOH NH3 + COO-

44、 NH2 COO-,,,,,,,,,+ H+ + OH-,pI pI,一. 蛋白質(zhì)具有兩性電離性質(zhì),帶正電荷 中性 帶負電荷,體內(nèi)大多數(shù)蛋白質(zhì)的pI值為5.0左右，在體液中帶負電荷,Isoelectric point (pI) --- 等電點,在某一pH溶液中，蛋白質(zhì)解離成正、負離子的趨勢相等，即成為兼性離子，凈電荷為零，此時溶液

45、的pH稱為蛋白質(zhì)的等電點。 pH pI：蛋白質(zhì)帶負電荷,,二. 蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì),生物大分子 -- MW: 10,000 ～ million -- diameter: 1～ 100nm 蛋白質(zhì)膠體穩(wěn)定的因素顆粒表面電荷水化膜,水化膜,溶液中蛋白質(zhì)的聚沉,（三）蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)破壞引起變性,在某些物理和化學因素(如加熱，強酸，強堿，有機溶劑等)作用下，蛋白質(zhì)的特定空間構(gòu)象被破壞，也即有序的空間結(jié)構(gòu)變

46、成無序的空間結(jié)構(gòu)，從而導致其理化性質(zhì)改變和生物活性的喪失。,變性的本質(zhì): 破壞非共價鍵和二硫鍵，不改變蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu),應(yīng)用舉例臨床醫(yī)學上，變性因素常被應(yīng)用來消毒及滅菌。防止蛋白質(zhì)變性是有效保存蛋白質(zhì)制劑（如酶,疫苗等）的必要條件(如低溫保存)。,若蛋白質(zhì)變性程度較輕，去除變性因素后，蛋白質(zhì)仍可恢復或部分恢復其原有的構(gòu)象和功能，稱為復性(renaturation) 。,Renaturation of protein (

47、蛋白質(zhì)復性),天然狀態(tài)，有催化活性,尿素、 β-巰基乙醇,,去除尿素、β-巰基乙醇,非折疊狀態(tài)，無活性,,變性,復性,Renaturation,denaturation,* 蛋白質(zhì)沉淀(protein precipitation) 在一定條件下，蛋白疏水側(cè)鏈暴露在外，肽鏈相互纏繞聚集，從溶液中析出。變性的蛋白質(zhì)易于沉淀，有時蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀，但并不變性。,* 蛋白質(zhì)的凝固作用(protein coagulation) 蛋白質(zhì)變性

48、后的絮狀物加熱可變成比較堅固的凝塊，此凝塊不易再溶于強酸和強堿中。,四.蛋白質(zhì)的紫外吸收,由于蛋白質(zhì)分子中含有共軛雙鍵的酪氨酸和色氨酸，因此在280nm波長處有特征性吸收峰。蛋白質(zhì)的OD280與其濃度呈正比關(guān)系，因此可作蛋白質(zhì)定量測定。,五. 蛋白質(zhì)的呈色反應(yīng)可用于蛋白質(zhì)溶液含量測定,⒈茚三酮反應(yīng)(ninhydrin reaction) 蛋白質(zhì)經(jīng)水解后產(chǎn)生的氨基酸也可發(fā)生茚三酮反應(yīng)。 ⒉雙縮脲反應(yīng)(biuret re

49、action) 蛋白質(zhì)和多肽分子中肽鍵在稀堿溶液中與硫酸銅共熱，呈現(xiàn)紫色，此反應(yīng)稱為雙縮脲反應(yīng)，可用來檢測蛋白質(zhì)含量和水解程度。,Proteomics 蛋白質(zhì)組學,Wilkins MR et al : proteome = PROTEin+genOME(蛋白質(zhì)組) “一種基因組所表達的全套蛋白質(zhì)”Swinbanks : “代表一完整生物的全套蛋白質(zhì)”Kahn P : “反映不

50、同細胞的不同蛋白質(zhì)組合” “蛋白質(zhì)組proteome” 有不同的含義： 廣義上講，一個基因組、一種生物或一種細胞/組織所表達的全套蛋白質(zhì)。 狹義：僅指特定的細胞或組織在特定的階段或與某一生理現(xiàn)象相關(guān)的所有蛋白質(zhì)。 具有時空性，比基因組研究更復雜。,(1) Definition:,蛋白質(zhì)組學（proteomics)研究細胞、組織或生物體蛋白質(zhì)組成及其變化規(guī)律的科學。差異蛋白質(zhì)組學、細胞蛋

51、白質(zhì)組學、結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學、功能蛋白質(zhì)組學、磷酸化蛋白質(zhì)組學、糖基化蛋白質(zhì)組學、臨床蛋白質(zhì)組學、疾病蛋白質(zhì)組學等。,(2) 蛋白質(zhì)組學研究技術(shù)平臺 (高效率,高通量) 雙向電泳分離樣品蛋白質(zhì) 蛋白質(zhì)點的定位和切取 蛋白質(zhì)點的質(zhì)譜分析(3) 研究的科學意義,生物學問題的提出,實驗?zāi)Ｐ偷脑O(shè)計,實驗組和對照組樣品的制備,蛋白樣品的IEF和PAGE電泳分離,圖像掃描和初步分析,感興趣蛋白點的切取,胰酶對蛋白質(zhì)的消化,質(zhì)譜的多肽指紋圖分析

52、,質(zhì)譜結(jié)果的生物信息學分析和比對,蛋白質(zhì)的鑒定,其它實驗的進一步驗證,,,,,,,,,,,蛋白質(zhì)組學流程圖,,,,蛋白質(zhì)樣品的色譜分離,Key terms,模體 (Motif )結(jié)構(gòu)域 (Domain)蛋白質(zhì)的變性(Denaturation of protein)蛋白質(zhì)的等電點 (pI),Thank You,If you have any questions, please don’t hesitate to ask !,粗提 -

53、-- 沉淀, 離心等,分離--- 電泳，層析等,純化 – 電泳，層析等,鑒定 --- HPLC, MS, NMR,,,,,第五節(jié) 蛋白質(zhì)的分離、純化與結(jié)構(gòu)分析,（一）透析及超濾法,* 透析(dialysis)利用透析袋把大分子蛋白質(zhì)與小分子化合物分開的方法。,* 超濾法 應(yīng)用正壓或離心力使蛋白質(zhì)溶液透過有一定截留分子量的超濾膜，達到濃縮蛋白質(zhì)溶液的目的。,透析 (Dialysis),（二）有機溶劑沉淀、鹽析及免疫沉淀,* 有機溶劑

54、：常用丙酮、乙醇等沉淀，濃度不能太高，低溫,* 鹽析(salt precipitation)是將高濃度中性鹽如硫酸銨、硫酸鈉或氯化鈉等加入蛋白質(zhì)溶液，使蛋白質(zhì)表面電荷被中和以及水化膜被破壞，導致蛋白質(zhì)沉淀。,agarose bead,免疫沉淀法（IP） 是利用抗原蛋白質(zhì)和抗體的特異性結(jié)合以及細菌蛋白質(zhì)的“protein A/G”能特異結(jié)合免疫球蛋白FC片段的現(xiàn)象而發(fā)展的方法。目前多用精制的protein A/G預先結(jié)合固化在agaro

55、se beads上，使之與含有抗原的溶液及抗體反應(yīng)后，beads上的prorein A/G就能吸附抗原抗體達到沉淀抗原的目的。,protein A,抗原,抗體,（三）電泳,蛋白質(zhì)在高于或低于其pI的溶液中為帶電的顆粒，在電場中能向正極或負極移動。這種通過蛋白質(zhì)在電場中泳動而達到分離各種蛋白質(zhì)的技術(shù), 稱為電泳(elctrophoresis) 。根據(jù)支撐物的不同，可分為薄膜電泳、凝膠電泳等。,幾種重要的蛋白質(zhì)電泳* SDS-聚丙烯酰

56、胺凝膠電泳（SDS-PAGE）， 常用于蛋白質(zhì)分子量的測定。* 等電聚焦電泳（IEF）， 通過蛋白質(zhì)等電點的差異而分離蛋白質(zhì)的電泳方法。* 雙向凝膠電泳（2D-gel）是蛋白質(zhì)組學研究的重要技術(shù)。,Electrophoresis,Estimating the molecular weight of a protein,Marker,（SDS-PAGE）,Isoelectric focusing （IEF）,Two-dimension

57、al electrophoresis,蛋白質(zhì)組學研究的重要技術(shù)之一,（四）層析 (chromatography),待分離蛋白質(zhì)溶液（流動相）經(jīng)過一個固態(tài)物質(zhì)（固定相）時，根據(jù)溶液中待分離的蛋白質(zhì)顆粒大小、電荷多少及親和力等，使待分離的蛋白質(zhì)組分在兩相中反復分配，并以不同速度流經(jīng)固定相而達到分離蛋白質(zhì)的目的 。,蛋白質(zhì)分離常用的層析方法 離子交換層析(ion exchange chromatography)：利用各蛋白質(zhì)的電荷量及性質(zhì)不

58、同進行分離。 凝膠過濾層析(gel filtration chromatography):又稱分子篩層析，利用各蛋白質(zhì)分子大小不同分離。 此外還有親和層析(Affinity chromatography), 疏水層析(Hydrophobic interaction chromatography), 高效液相層析(High-performance liquid chromatography)等。,gel filtration chro

59、matography,Separates proteins by size,Ion-exchange chromatography Separates proteins by charge,Separates proteins by their binding specificities,Affinity chromatography,（五）超速離心,* 超速離心法(ultracentrifugation)既可以用來分離純化蛋白質(zhì)

60、也可以用作測定蛋白質(zhì)的分子量。,*蛋白質(zhì)在離心場中的行為用沉降系數(shù)(sedimentation coefficient, S)表示,沉降系數(shù)與蛋白質(zhì)的密度和形狀相關(guān)。因為沉降系數(shù)S大體上和分子量成正比關(guān)系，故可應(yīng)用超速離心法測定蛋白質(zhì)分子量，但對分子形狀高度不對稱的大多數(shù)纖維狀蛋白質(zhì)不適用。,（六）多肽鏈中氨基酸序列分析,分析已純化蛋白質(zhì)的氨基酸殘基組成,測定多肽鏈的氨基末端與羧基末端為何種氨基酸殘基,把肽鏈水解成片段，分別進行分析,測

61、定各肽段的氨基酸排列順序，一般采用Edman降解法,一般需用數(shù)種水解法，并分析出各肽段中的氨基酸順序，然后經(jīng)過組合排列對比，最終得出完整肽鏈中氨基酸順序的結(jié)果。,,,,,通過核酸來推演蛋白質(zhì)中的氨基酸序列,按照三聯(lián)密碼的原則推演出氨基酸的序列,分離編碼蛋白質(zhì)的基因,測定DNA序列,排列出mRNA序列,,,,7. 蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)測定Spatial structure determination,* 二級結(jié)構(gòu)測定 通常采

62、用圓二色光譜(circular dichroism，CD)測定溶液狀態(tài)下的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)含量。 ?-螺旋的CD峰有222nm處的負峰、208nm處的負峰和198 nm處的正峰三個成分；而?-折疊的CD譜不很固定。,crystal preparation,,X-ray diffraction , NMR,* 三級結(jié)構(gòu)測定X射線衍射法(X-ray diffraction)和核磁共振技術(shù)(nuclear magnetic resonance