大西洋Cadiz灣泥火山富集樣品中N5,N10-亞甲基四氫甲烷喋呤還原酶(Mer)來源的初步研究.pdf

1、甲烷是大氣中含量最為豐富的碳?xì)浠衔?是引起全球變暖的主要溫室氣體之一。在占地球面積71％的海洋里,厭氧甲烷氧化作用消耗了超過90%海洋年甲烷釋放量。研究海洋深部生物圈微生物參與的厭氧甲烷氧化過程不僅能深入探究碳的生物循環(huán)在地球碳循環(huán)中的重要意義,還能了解海洋對(duì)全球氣候變暖的作用。因此,微生物尤其是厭氧甲烷氧化古菌(ANME)參與的厭氧甲烷氧化作用成為近年來國際上的研究熱點(diǎn)。
　　 ANME參與的厭氧甲烷氧化作用通常與硫酸鹽還原

2、作用偶聯(lián)。目前己報(bào)道ANME中厭氧甲烷氧化途徑的研究結(jié)果主要基于宏基因組測序,并推測厭氧甲烷氧化途徑是產(chǎn)甲烷途徑的逆過程。盡管已從核酸水平證明ANME中含有除Mer蛋白外參與厭氧甲烷氧化途徑的全部酶,但既未找到Mer蛋白存在的證據(jù),又無充足證據(jù)證明該步驟被其它分支途徑取代。本實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)大西洋Cadiz灣泥火山(冷泉)樣品富集物的宏基因組測序結(jié)果中發(fā)現(xiàn)存在兩類Mer蛋白編碼基因mer-1和met-2:16S rRNA文庫測序結(jié)果表明該樣

3、品古菌僅有ANME-2a和MBGD(Marine Bemhic Group D)兩個(gè)類群,且ANME-2a占優(yōu)勢。因此,推測mer基因很可能來自于占優(yōu)勢的ANME-2a類群?；谝陨涎芯拷Y(jié)果構(gòu)建mer基因系統(tǒng)進(jìn)化樹,發(fā)現(xiàn)mer-2基因位于產(chǎn)甲烷古菌分支,推測可能來源于ANME-2a類群。因此,本研究通過一系列實(shí)驗(yàn)方法對(duì)mer-2基因的來源進(jìn)行初步研究,并對(duì)克隆得到的mer-2基因及其上下游基因進(jìn)行分析。
　　 本研究先對(duì)冷泉富集

4、物樣品進(jìn)行HF處理、超聲波處理、HC1和紫外處理,從沉積物顆粒中分離微生物細(xì)胞并降低背景熒光強(qiáng)度對(duì)熒光顯微鏡鏡檢和流式細(xì)胞分選過程的干擾:然后利用FISH方法將ANME-2a古菌與熒光標(biāo)記的特異性核酸探針雜交,獲得帶有熒光標(biāo)記的陽性ANME-2a細(xì)胞:再通過流式細(xì)胞儀分選帶有熒光標(biāo)記的ANME-2a細(xì)胞;最后設(shè)計(jì)mer-2基因特異性引物通過PCR方法ANME-2a細(xì)胞中克隆該基因。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,經(jīng)過物理/化學(xué)方法處理后,樣品的背景顆粒物

5、自發(fā)熒光強(qiáng)度明顯下降,且鏡檢未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞團(tuán)。為確定分選效率,將弧菌與FISH雜交的大腸桿菌以不同比例混合,流式細(xì)胞分選并對(duì)分選結(jié)果鏡檢計(jì)數(shù),確定"single cell mehod"模式對(duì)冷泉富集樣品中ANME-2a細(xì)胞分選。最后用PCR方法擴(kuò)增流式細(xì)胞分選獲得ANME-2a中的mer-2基因。結(jié)合前期宏基因組測序和構(gòu)建的mer-2基因系統(tǒng)進(jìn)化樹,證明ANME-2a類群基因組中含有mer基因。
　　 由于ANME為未培養(yǎng)古菌,為獲

6、得更多ANME-2a類群遺傳信息,本研究通過構(gòu)建fosmid文庫的方法,篩選含有mer-2基因的插入片段,測序并對(duì)序列進(jìn)行ORF預(yù)測。從獲得的ORF結(jié)果發(fā)現(xiàn)輔因子F420脫氫酶F亞基編碼基因位于mer基因下游,這與其它產(chǎn)甲烷古菌基因組中兩個(gè)基因同時(shí)出現(xiàn)的結(jié)果一致。此外,除假定蛋白外,該插入片段還包含能量代謝、糖代謝、膜蛋白、核酸修飾、轉(zhuǎn)座以及多個(gè)輔酶的合成代謝等相關(guān)蛋白的編碼基因。這些基因的出現(xiàn)為我們了解ANME-2a類群的遺傳和生理生

7、化功能提供了信息。對(duì)克隆得到的mer-2基因分析表明,其編碼的Mer-2蛋白與產(chǎn)甲烷古菌中的Mer蛋白具有相同的保守結(jié)構(gòu)域。因此,推測mer-2基因可能來源于Methanosarcinales目產(chǎn)甲烷古菌,并能編碼具有Mer蛋白功能活性的基因。但其厭氧甲烷氧化功能尚待進(jìn)一步驗(yàn)證。
　　 本研究還嘗試從珠江口沉積物和九龍江口沉積物中分選泉古菌Miscellareous Crenarchaeotic Group(MCG)細(xì)胞,但FI

8、SH雜交后未觀察到MCG細(xì)胞。究其原因有二:一、河口沉積物不同于冷泉沉積物,同樣的樣品處理方法無法達(dá)到充分降低背景熒光干擾的目的,針對(duì)河口沉積物樣品的處理?xiàng)l件有待進(jìn)一步優(yōu)化;二、目前尚無可供參考的MCG特異性核酸探針及雜交條件,探針的設(shè)計(jì)及雜交條件尚需進(jìn)一步優(yōu)化。
　　 綜上所述,ANME-2a古菌中mer基因的發(fā)現(xiàn)填補(bǔ)了以往報(bào)道ANME類群的厭氧甲烷氧化途徑研究中mer基因缺失的空白,證明ANME-2a類群有完整的厭氧甲烷氧化