茶葉中二氫黃酮醇還原酶-無色花青素還原酶性質(zhì)研究.pdf

1、兒茶素類是茶多酚的主體組分,是茶葉最重要的特征代謝成分,同時(shí)也是構(gòu)成茶葉品質(zhì)的主要化學(xué)成分。 兒茶素合成途徑中可能涉及的酶類有肉桂酸羧化酶(C4H)、4-香豆酰CoA連接酶(4CL)、查耳酮合成酶(CHS)、查耳酮異構(gòu)酶(CHI)、二氫黃酮3-羥化酶(F3H)、二氫黃烷醇4-還原酶(DFK)、無色花色素還原酶(LAR)、花青素還原酶(ANR)等。DFR/LAR是黃酮類化合物合成下游途徑中的重要酶類,在兒茶素合成途徑中具有重要的調(diào)

2、節(jié)作用。本課題對(duì)茶葉中DFR/LAR酶反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行了鑒定,建立了DFR/LAR酶活性的簡單測定方法,較系統(tǒng)地研究了DFR/LAR的動(dòng)力學(xué)性質(zhì),并探討了不同部位茶鮮葉和茶細(xì)胞系中兒茶素C和GC與DFR/LAR活性間的相關(guān)性。主要研究結(jié)果如下： 1.利用高效液相色譜(HPLC)、薄層層析(TLC)、紫外可見光掃描和香草醛-鹽酸比色法分別對(duì)DFR/LAR酶促反應(yīng)的產(chǎn)物無色花青素、兒茶素C和GC進(jìn)行了鑒定。在此基礎(chǔ)上,建立了1％香草醛-

3、鹽酸比色法檢測DFR/LAR酶活性的簡便方法。 2.建立了以輔酶NADPH在反應(yīng)體系中的消耗為基礎(chǔ)的DRF/LAR酶活性檢測方法。 3.采用1％香草醛-鹽酸比色法、NADPH消耗方法分別對(duì)DRF/LAR酶動(dòng)力學(xué)特征進(jìn)行了研究,結(jié)果表明,當(dāng)?shù)孜餅槎溟纹に?DHQ)時(shí),DRF/LARDHQ酶反應(yīng)的最適溫度在45～65℃表現(xiàn)最高、最適pH為5.0、7.5～8.0;當(dāng)?shù)孜餅槎錀蠲匪?DHM)時(shí),DRF/LARDHM酶反應(yīng)的最

4、適溫度為45℃、最適pH為7.0。底物濃度與酶反應(yīng)速率間的關(guān)系不表現(xiàn)為典型的米氏方程,存在底物抑制現(xiàn)象,經(jīng)直接線性作圖法得到兩種底物的四個(gè)表觀米氏常數(shù)為KNADPH-DHQ=0.888 mmol/L、KNADPH-DHM=0.925 mmol/L、KDHQ-NADPH=0.337 mmol/L、KDHM-NADPH=1.145 mmol/L。研究結(jié)果還顯示,4mmol/L,Mg2+、100mmol/ L SDS對(duì)DRF/LAR的活性有一

5、定提高；EDTA在0～1 mmol/L 范圍內(nèi)對(duì)DRF/LAR活性有極強(qiáng)的抑制作用,而Fe3+在0～1 mmol/L范圍內(nèi)對(duì)DRF/LAR活性有一定的抑制作用。 4.對(duì)不同部位茶鮮葉與茶細(xì)胞系云莖63中的總兒茶素含量、兒茶素C和沒食子兒茶素GC含量、DRF/LAR酶活性進(jìn)行了測定,結(jié)果表明,無論茶鮮葉還是細(xì)胞系,DRF/LAR DHM的酶活性均高于DRF/LARDHQ;隨著茶鮮葉成熟度的增加,DRF/LAR酶活性逐步下降,兒茶素