流式b封閉抗體

1、HLA-B27/封閉抗體檢測(cè)臨床應(yīng)用,,主要內(nèi)容,一、流式細(xì)胞儀簡(jiǎn)介二、人類白細(xì)胞抗原（HLA-B27）中的臨床應(yīng)用三、封閉抗體檢測(cè)在臨床中的應(yīng)用,流式細(xì)胞術(shù),,,流動(dòng),,細(xì)胞,,測(cè)量術(shù),,,Flow Cytometry (FCM),Fluorescence-activated cell-sorting (FACS),流式細(xì)胞術(shù),流式細(xì)胞術(shù),快速檢測(cè)流動(dòng)的單細(xì)胞或顆粒，達(dá)上萬(wàn)個(gè)/每秒檢測(cè)物可以是細(xì)胞、細(xì)菌或各種微粒，0.5 -

2、50 mm范圍內(nèi),,多參數(shù)同時(shí)分析，F(xiàn)S/SS/FLs (熒光) 可分析，可分選,特 點(diǎn),特 點(diǎn)：,人類白細(xì)胞抗原系統(tǒng)（Human Leucocyte Antigen,HLA），俗稱為白細(xì)胞血型，是人類的組織相容性抗原，HLA抗原受控于HLA基因。 HLA基因是由一組高度多態(tài)性基因組成的染色體區(qū)域，因其產(chǎn)物代表移植供者與受者相互接受的程度，故又稱其產(chǎn)物為移植抗原或組織相容性抗原。,一、HLA簡(jiǎn)介,HLA基因遺傳區(qū)

3、域位于人類第六號(hào)染色體短臂，區(qū)域內(nèi)包含224個(gè)基因座位,已發(fā)現(xiàn)的等位基因數(shù)共1288種。根據(jù)編碼分子的特性不同，可將整個(gè)復(fù)合體的基因分成：I類、 II類、III類。,I 類基因：區(qū)位于著絲點(diǎn)的遠(yuǎn)端，主要包括HLA-A、B、C三個(gè)位點(diǎn)，各位點(diǎn)有數(shù)目不同的等位基因，HLA-B27是B位點(diǎn)的一個(gè)等位基因。 II 類基因區(qū)：位于著絲點(diǎn)的近端，主要由DR、DQ、DP三個(gè)亞區(qū)構(gòu)成，每個(gè)亞區(qū)又分若干個(gè)位點(diǎn)。在B細(xì)胞和上表達(dá)，這兩類抗原都與移植有關(guān)

4、 III 類基因區(qū)： 含有編碼補(bǔ)體成分C2、C4、B因子及TNF、熱休克蛋白和21羥化酶的基因，其產(chǎn)物是一些可溶性蛋白質(zhì)。,一、HLA-B27,HLA-B27抗原屬于HLA-Ⅰ類抗原，由α和β兩條肽鏈組成。第6號(hào)染色體的HLA-Ⅰ類基因編碼α鏈，15號(hào)染色體編碼β鏈?；旧媳磉_(dá)在機(jī)體所有有核細(xì)胞上，尤其是淋巴細(xì)胞表面含量豐富。目前，在HLA與疾病的關(guān)聯(lián)研究中，較有臨床應(yīng)用價(jià)值的當(dāng)數(shù)HLA-B27與強(qiáng)直性脊柱炎的關(guān)聯(lián)。在診斷和鑒

5、別強(qiáng)直性脊柱炎中有重要的應(yīng)用價(jià)值。,,二、 HLA-B27檢測(cè)方法,1.HLA-B27抗原檢測(cè)CDC: 微量淋巴細(xì)胞毒法FCM :流式細(xì)胞學(xué)法2.HLA-B27基因?qū)W檢測(cè)熒光定量PCR,（一）微量淋巴細(xì)胞毒法1. 原理：待檢的淋巴細(xì)胞表面的HLA-B27抗原與已知的HLA-B27抗體結(jié)合，在補(bǔ)體的參入下，導(dǎo)致細(xì)胞膜溶解，能透過(guò)染料使細(xì)胞著色，在顯微鏡下判斷HLA-B27為陽(yáng)性，不著色為陰性。2.方法學(xué)應(yīng)用評(píng)價(jià)： 該

6、方法結(jié)果穩(wěn)定，可靠，不需要特殊儀器，是目前通用的方法，一般實(shí)驗(yàn)室均可開(kāi)展。,,（二）流式細(xì)胞學(xué)法,1.原理：利用熒光標(biāo)記的抗B27的單抗與淋巴細(xì)胞表面B27抗原結(jié)合，使細(xì)胞帶有熒光強(qiáng)度，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，判斷B27抗原陽(yáng)性或陰性。2.方法學(xué)應(yīng)用評(píng)價(jià)：優(yōu)點(diǎn)：無(wú)須分離淋巴細(xì)胞，操作簡(jiǎn)便、快速、標(biāo)本用量少，自動(dòng)化程度高，特異性高，穩(wěn)定性好，重復(fù)性高，結(jié)果判斷準(zhǔn)確，減少了人為因素的影響，為目前較為理想的方法 。缺點(diǎn):是儀器昂貴，目前只在較大

7、醫(yī)院應(yīng)用。,（三）熒光定量PCR,1.實(shí)驗(yàn)原理：在PCR反應(yīng)體系中，加入熒光染料， 特異地?fù)饺隓NA雙鏈后發(fā)射熒光信號(hào)，而不摻入熒光染料的DNA分子不會(huì)發(fā)射任何熒光信號(hào)，通過(guò)檢測(cè)熒光信號(hào)的強(qiáng)度，達(dá)到檢測(cè)PCR產(chǎn)物擴(kuò)增的目的。2.優(yōu)點(diǎn)：基因水平的檢測(cè)，直接對(duì)HLA-B27原基因進(jìn)行擴(kuò)增分型，靈敏度高，特異性強(qiáng)。 缺點(diǎn)：需要特定的實(shí)驗(yàn)儀器及嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)條件和熟練操作技術(shù)，在臨床上普遍開(kāi)展此項(xiàng)檢查有一定的難處。,四、HLA-B27檢測(cè)

8、與強(qiáng)直性脊柱炎應(yīng)用評(píng)價(jià),1.普通人群中HLA-B27陽(yáng)性率有種族與地區(qū)差異：不同作者報(bào)道不盡一致，白種人4%-13%，黑種人2%左右，日本人0.2%，中國(guó)人2%-19%。2.B27與AS強(qiáng)相關(guān)聯(lián)，中國(guó)人AS患者HLA-B27陽(yáng)性率65-100%。絕大多數(shù)B27陽(yáng)性者并未患AS，所以，B27檢測(cè)不可以作為AS的篩查指標(biāo)。3.HLA-B27表達(dá)已成為臨床診斷與鑒別診斷血清陰性脊柱關(guān)節(jié)病的最常用實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)。,,4. AS診斷主要靠臨床

9、檢查和影像學(xué)改變，提示的雙側(cè)骶髂關(guān)節(jié)炎和脊柱炎。結(jié)合HLA-B27陽(yáng)性，診斷AS。HLA-B27陰性不能排除AS。5.如果癥狀和體征脊柱關(guān)節(jié)病變發(fā)生的可能性超過(guò)50%，那么，B27陽(yáng)性顯著增加正確診斷的機(jī)會(huì)。6.一級(jí)親屬HLA-B27出現(xiàn)率25%-100%，預(yù)測(cè)患者家屬成員發(fā)生AS的可能性。治療性選擇胎兒。7.AS與HLA-B27高度相關(guān)，表明AS是一種遺傳易感性疾病。,二、流式在封閉抗體中的應(yīng)用,封閉抗體檢測(cè),,,,,概

10、念,為什么做,怎樣做,如何解讀,基本概念,反復(fù)自然流產(chǎn) 自然流產(chǎn)連續(xù)或不連續(xù)發(fā)生2次或2次以上者，約占總?cè)焉飻?shù)的0.5%~3.0%病因 解剖因素、遺傳因素、內(nèi)分泌因素、感染因素、男方因素、免疫學(xué)因素（>50%）,,RSA 自身免疫型：與自身免疫病相關(guān)的自身抗體相關(guān)，如SLE、RA等 同種免疫型：封閉抗體，如：抗HLA抗體、抗滋養(yǎng)細(xì)胞淋巴細(xì)胞交叉反應(yīng)抗原抗體（TLX）;非特異性BA、

11、特異性非細(xì)胞毒抗體、抗獨(dú)特型抗體等 主動(dòng)免疫療法所產(chǎn)生的BA部分是針對(duì)TLX的，因此，當(dāng)夫妻雙方TLX相似時(shí)，不能激發(fā)母體產(chǎn)生BA,封閉抗體的作用 1.一種抗配偶淋巴細(xì)胞的特異性IgG類抗體，存在于正常孕婦的血清中，能夠抑制淋巴細(xì)胞反應(yīng)，封閉母體淋巴細(xì)胞對(duì)胚胎滋養(yǎng)層的細(xì)胞毒作用。2.防止輔助性T細(xì)胞識(shí)別胎兒抗原的抑制物，并可阻止母親免疫系統(tǒng)對(duì)胚胎的攻擊。3.封閉同種抗原刺激的淋巴細(xì)胞產(chǎn)生巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子

12、。,封閉抗體的作用,,,,,,,,,,,,,父系抗原,母體淋巴細(xì)胞,封閉抗體,,,,,,,,,,,,,沒(méi)有封閉抗體,,,,,胎兒不受母體攻擊,胎兒被母體攻擊，導(dǎo)致流產(chǎn),封閉抗體檢測(cè)方法-如何做,細(xì)胞毒試驗(yàn)ELISA流式細(xì)胞術(shù),流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)封閉抗體流程,標(biāo)本：男女雙方EDTA抗凝全血方法： 室溫孵育 裂解紅細(xì)胞 上機(jī) 計(jì)算公式：封閉效率=對(duì)照管CD%-實(shí)驗(yàn)管