第六章-長沙醫(yī)學院

1、第六章,生物氧化 Biological Oxidation,臨床生物化學教研室 羅潔講師,物質在生物體內進行氧化稱生物氧化(biological oxidation)，主要指糖、脂肪、蛋白質等在體內分解時逐步釋放能量，最終生成CO2 和 H2O的過程。,CO2和H2O,,O2,能量,,ADP+Pi,ATP,熱能,生物氧化的概念,生物氧化與體外氧化之相同點,生物氧化中物質的氧化方式有加氧、脫氫、失電子，遵循氧化還原反

2、應的一般規(guī)律。質在體內外氧化時所消耗的氧量、最終產物(CO2，H2O)和釋放能量均相同。,反應環(huán)境溫和，酶促反應逐步進行，能量逐步釋放，能量容易捕獲，ATP生成效率高。通過加水脫氫反應使物質能間接獲得氧，并增加脫氫的機會；脫下的氫與氧結合產生H2O，有機酸脫羧產生CO2。,生物氧化與體外氧化之不同點,生物氧化,體外氧化,能量突然釋放。 物質中的碳和氫直接氧結合生成CO2和H2O 。,乙酰CoA,TAC,,2H,,呼吸鏈,H2O

3、,ADP+Pi,ATP,,,,CO2,生物氧化的一般過程,第一節(jié) 生成ATP的氧化磷酸化體系,,The Oxidative Phosphorylation System with ATP Producing,指線粒體內膜中按一定順序排列的一系列具有電子傳遞功能的酶復合體，可通過鏈鎖的氧化還原將代謝物脫下的電子最終傳遞給氧生成水。這一系列酶和輔酶稱為呼吸鏈(respiratory chain)又稱電子傳遞鏈(electron tran

4、sfer chain)。,一、呼吸鏈,定義,遞氫體和電子傳遞體（2H ? 2H+ + 2e）,組成,酶復合體是線粒體內膜氧化呼吸鏈的天然存在形式，所含各組分具體完成電子傳遞過程。電子傳遞過程釋放的能量驅動H+移出線粒體內膜，轉變?yōu)榭鐑饶+梯度的能量，再用于ATP的生物合成。,（一）氧化呼吸鏈由4種具有傳遞電子能力的復合體組成,人線粒體呼吸鏈復合體,泛醌不包含在上述四種復合體中。,復合體Ⅰ又稱NADH-泛醌還原酶。復合體Ⅰ電子傳遞：N

5、ADH→FMN→Fe-S→ CoQ→ Fe-S→ CoQ 每傳遞2個電子可將4個H+從內膜基質側泵到胞漿側，復合體Ⅰ有質子泵功能。,1、復合體Ⅰ作用是將NADH+H+中的電子傳遞給泛醌(ubiquinone),NAD+和NADP+的結構,R=H: NAD+; R=H2PO3: NADP+,NAD+（NADP+）和NADH（NADPH）相互轉變,氧化還原反應時變化發(fā)生在五價氮和三價氮之間。,FMN結構中含核黃素，發(fā)揮功能的部位

6、是異咯嗪環(huán)，氧化還原反應時不穩(wěn)定中間產物是FMN·。在可逆的氧化還原反應中顯示3種分子狀態(tài)，屬于單、雙電子傳遞體。,,鐵硫蛋白中輔基鐵硫中心(Fe-S)含有等量鐵原子和硫原子，其中一個鐵原子可進行Fe2+ ? Fe3++e 反應傳遞電子。屬于單電子傳遞體。,? 表示無機硫,鐵硫蛋白,泛醌（輔酶Q, CoQ, Q）由多個異戊二烯連接形成較長的疏水側鏈（人CoQ10），氧化還原反應時可生成中間產物半醌型泛醌。內膜中可移動電子載體，

7、在各復合體間募集并穿梭傳遞還原當量和電子。在電子傳遞和質子移動的偶聯(lián)中起著核心作用。,復合體Ⅰ的功能,復合體Ⅱ是三羧酸循環(huán)中的琥珀酸脫氫酶，又稱琥珀酸-泛醌還原酶。電子傳遞：琥珀酸→FAD→幾種Fe-S →CoQ復合體Ⅱ沒有H+泵的功能。,2、復合體Ⅱ功能是將電子從琥珀酸傳遞到泛醌。,3、復合體Ⅲ功能是將電子從還原型泛醌傳遞給細胞色素c。,復合體Ⅲ又叫泛醌-細胞色素C還原酶，細胞色素b-c1復合體，含有細胞色素b(b562, b56

8、6)、細胞色素c1和一種可移動的鐵硫蛋白(Rieske protein)。泛醌從復合體Ⅰ、Ⅱ募集還原當量和電子并穿梭傳遞到復合體Ⅲ。電子傳遞過程：CoQH2→(Cyt bL→Cyt bH) →Fe-S →Cytc1→Cytc,細胞色素(cytochrome, Cyt),細胞色素是一類以鐵卟啉為輔基的催化電子傳遞的酶類，根據(jù)它們吸收光譜不同而分類。,復合體Ⅲ的電子傳遞通過“Q循環(huán)”實現(xiàn)。復合體Ⅲ每傳遞2個電子向內膜胞漿側釋放4個H+

9、，復合體Ⅲ也有質子泵作用。Cyt c是呼吸鏈唯一水溶性球狀蛋白，不包含在復合體中。將獲得的電子傳遞到復合體Ⅳ。,復合體Ⅳ又稱細胞色素C氧化酶(cytochrome c oxidase)。電子傳遞：Cyt c→CuA→Cyt a→Cyt a3–CuB→O2Cyt a3–CuB形成活性雙核中心，將電子傳遞給O2。每2個電子傳遞過程使2個H+跨內膜向胞漿側轉移 。,4、復合體Ⅳ將電子從細胞色素C傳遞給氧,復合體Ⅳ的電子傳遞過程,細胞色素

10、c氧化酶CuB-Cyta3中心使O2還原成水的過程，有強氧化性中間物始終和雙核中心緊密結合，不會引起細胞損傷。,標準氧化還原電位拆開和重組特異抑制劑阻斷還原狀態(tài)呼吸鏈緩慢給氧,（二）氧化呼吸鏈組分按氧化還原電位由低到高的順序排列,由以下實驗確定:,呼吸鏈中各種氧化還原對的標準氧化還原電位,,1、NADH氧化呼吸鏈NADH →復合體Ⅰ→Q →復合體Ⅲ→Cyt c →復合體Ⅳ→O22、琥珀酸氧化呼吸鏈 琥珀酸 →復合體Ⅱ →Q

11、→復合體Ⅲ→Cyt c →復合體Ⅳ→O2,二、氧化磷酸化將氧化呼吸鏈釋能與ADP磷酸化生成ATP偶聯(lián),氧化磷酸化 (oxidative phosphorylation)是指在呼吸鏈電子傳遞過程中偶聯(lián)ADP磷酸化，生成ATP，又稱為偶聯(lián)磷酸化。底物水平磷酸化(substrate level phosphorylation)與脫氫反應偶聯(lián)，生成底物分子的高能鍵，使ADP(GDP)磷酸化生成ATP(GTP)的過程。不經電子傳遞。,ATP生成

12、方式,（一）氧化磷酸化偶聯(lián)部位在復合體Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ內,根據(jù)P/O比值自由能變化: ⊿Gº'=-nF⊿Eº',氧化磷酸化偶聯(lián)部位：復合體Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ,1、P/O 比值,指氧化磷酸化過程中，每消耗1/2摩爾O2所生成ATP的摩爾數(shù)（或一對電子通過氧化呼吸鏈傳遞給氧所生成ATP分子數(shù)）。,2、自由能變化,根據(jù)熱力學公式，pH7.0時標準自由能變化(△G0′)與還原電位變化(△E0′)之間有以下關系：,n為傳遞

13、電子數(shù)；F為法拉第常數(shù)(96.5kJ/mol·V),△G0′ = -nF△E0′,電子傳遞鏈自由能變化,氧化磷酸化偶聯(lián)部位,(二)氧化磷酸化偶聯(lián)機制是產生跨線粒體內膜的質子梯度,1、化學滲透假說(chemiosmotic hypothesis),,電子經呼吸鏈傳遞時，可將質子(H+)從線粒體內膜的基質側泵到內膜胞漿側，產生膜內外質子電化學梯度儲存能量。當質子順濃度梯度回流時驅動ADP與Pi生成ATP。,氧化磷酸化依賴于完整封閉

14、的線粒體內膜；線粒體內膜對H+、OH－、K＋、Cl－離子是不通透的；電子傳遞鏈可驅動質子移出線粒體，形成可測定的跨內膜電化學梯度；增加線粒體內膜外側酸性可導致ATP合成，而線粒體內膜加入使質子通過物質可減少內膜質子梯度，結果電子雖可以傳遞，但ATP生成減少。,化學滲透假說已經得到廣泛的實驗支持。,化學滲透假說簡單示意圖,胞液側,基質側,電子傳遞過程復合體Ⅰ (4H+) 、Ⅲ (4 H+)和Ⅳ (2H+)有質子泵功能。,化學滲透示意

15、圖及各種抑制劑對電子傳遞鏈的影響,（三）質子順梯度回流釋放能量被ATP合酶利用催化ATP合成,F1：親水部分 （動物：α3β3γδε亞基復合體，OSCP、IF1 亞基），線粒體內膜的基質側顆粒狀突起，催化ATP合成。 F0：疏水部分（ab2c9~12亞基，動物還有其他輔助亞基），鑲嵌在線粒體內膜中，形成跨內膜質子通道 。,ATP合酶結構組成,ATP合酶組成可旋轉的發(fā)動機樣結構,F0的2個b亞基的一端錨定F1的α亞基，另一端通過δ和α3

16、β3穩(wěn)固結合，使a、b2和α3β3、δ亞基組成穩(wěn)定的定子部分。部分γ和ε亞基共同形成穿過α3β3間中軸，γ還與1個β亞基疏松結合作用，下端與嵌入內膜的c亞基環(huán)緊密結合。c亞基環(huán)、γ和ε亞基組成轉子部分。 質子順梯度向基質回流時，轉子部分相對定子部分旋轉，使ATP合酶利用釋放的能量合成ATP。,當H+順濃度遞度經F0中a亞基和c亞基之間回流時，γ亞基發(fā)生旋轉，3個β亞基的構象發(fā)生改變。,ATP合酶的工作機制,ATP合成的結合變構機制(

17、binding change mechanism),三、氧化磷酸化作用可受某些內外源因素影響,（一）有3類氧化磷酸化抑制劑,1、呼吸鏈抑制劑阻斷氧化磷酸化的電子傳遞過程,復合體Ⅰ抑制劑：魚藤酮(rotenone)、粉蝶霉素A(piericidin A)及異戊巴比妥(amobarbital)等阻斷傳遞電子到泛醌 。復合體Ⅱ的抑制劑：萎銹靈(carboxin)。,復合體Ⅲ抑制劑：抗霉素A(antimycin A)阻斷Cyt bH傳遞電子到

18、泛醌(QN) ；粘噻唑菌醇則作用QP位點。復合體Ⅳ 抑制劑：CN－、N3－緊密結合中氧化型Cyt a3，阻斷電子由Cyt a到CuB- Cyt a3間傳遞。CO與還原型Cyt a3結合，阻斷電子傳遞給O2。,魚藤酮粉蝶霉素A異戊巴比妥,,×,抗霉素A二巰基丙醇,,×,CO、CN-、N3-及H2S,,×,各種呼吸鏈抑制劑的阻斷位點,不同底物和抑制劑對線粒體氧耗的影響,2、解偶聯(lián)劑破壞電子傳遞建立的跨

19、膜質子電化學梯度,解偶聯(lián)劑(uncoupler)可使氧化與磷酸化的偶聯(lián)相互分離，基本作用機制是破壞電子傳遞過程建立的跨內膜的質子電化學梯度，使電化學梯度儲存的能量以熱能形式釋放，ATP的生成受到抑制。 如：二硝基苯酚(dinitrophenol, DNP) ；解偶聯(lián)蛋白(uncoupling protein，UCP1)。,解偶聯(lián)蛋白作用機制（棕色脂肪組織線粒體）,Ⅲ,Q,胞液側,基質側,解偶聯(lián) 蛋白,3、ATP合酶抑制劑同時抑制電

20、子傳遞和ATP的生成,這類抑制劑對電子傳遞及ADP磷酸化均有抑制作用。例如寡霉素(oligomycin)可結合F0單位，二環(huán)己基碳二亞胺(dicyclohexyl carbodiimide, DCCP)共價結合F0的c亞基谷氨酸殘基，阻斷質子從F0質子半通道回流，抑制ATP合酶活性。由于線粒體內膜兩側質子電化學梯度增高影響呼吸鏈質子泵的功能，繼而抑制電子傳遞。,寡霉素(oligomycin),寡霉素,ATP合酶結構模式圖,可阻止質子從F

21、0質子通道回流，抑制ATP生成。,Na+，K+–ATP酶和解偶聯(lián)蛋白基因表達均增加。,（二）ADP 是調節(jié)正常人體氧化磷酸化速率的主要因素。,呼吸控制率(respiratory control ratio, RCR),（三）甲狀腺激素刺激機體耗氧量和產熱同時增加。,（四）線粒體DNA突變可影響機體氧化磷酸化功能。,電子傳遞鏈及氧化磷酸化系統(tǒng)概貌,ΔμH+ 跨膜質子電化學梯度；H+m內膜基質側H+；H+c 內膜胞液側H+,四、ATP在能量

22、的生成、利用、轉移和儲存中起核心作用,,高能磷酸鍵水解時釋放的能量大于21kJ/mol的磷酸酯鍵，常表示為?P。高能磷酸化合物含有高能磷酸鍵的化合物,,一些重要有機磷酸化合物水解釋放的標準自由能,肌酸激酶的作用,磷酸肌酸作為肌肉和腦組織中能量的一種貯存形式。,ATP的生成和利用,ATP,ADP,機械能(肌肉收縮)滲透能(物質主動轉運) 化學能(合成代謝)電能(生物電)熱能(維持體溫),生物體內能量的儲存和利用都以ATP為

23、中心。,五、線粒體內膜對各種物質進行選擇性轉運,線粒體外膜通透性高，線粒體對物質通過的選擇性主要依賴于內膜中不同轉運蛋白(transporter)對各種物質的轉運。,線粒體內膜的某些轉運蛋白對代謝物的轉運,（一）胞漿中NADH通過穿梭機制進入線粒體氧化呼吸鏈,,胞漿中NADH必須經一定轉運機制進入線粒體，再經呼吸鏈進行氧化磷酸化。,α-磷酸甘油穿梭(α-glycerophosphate shuttle)蘋果酸-天冬氨酸穿梭 (mal

24、ate-asparate shuttle),轉運機制：,1、α-磷酸甘油穿梭主要存在于腦和骨骼肌中,NADH+H+,FADH2,NAD+,FAD,線粒體 內膜,線粒體 外膜,膜間隙,線粒體 基質,,,磷酸二羥丙酮,α-磷酸甘油,2、蘋果酸-天冬氨酸穿梭主要存在于肝和心肌中,NADH +H+,NAD+,,,,,谷氨酸-天冬氨酸 轉運體,蘋果酸-α-酮 戊二酸轉運體,蘋果酸,草酰乙酸,α-酮戊二酸,谷氨酸,胞液,線粒體

25、內膜,基質,天冬氨酸,（二）ATP-ADP轉位酶促進ADP進入和ATP移出緊密偶聯(lián),ATP4-,ADP3-,H2PO4-,每分子ATP4-和ADP3-反向轉運時，向內膜外凈轉移1個負電荷 ，相當于多1個H+轉入線粒體基質。,第二節(jié) 其他不生成ATP的氧化體系,The Others Oxidative Enzyme Systems without ATP Producing,一、抗氧化酶體系有清除反應活性氧類的功能,反應活性氧類

26、(reactive oxygen species, ROS),ROS主要來源,線粒體：超氧陰離子O·-2，是體內O·-2的主要來源； O·-2在線粒體中再生成H2O2和·OH。過氧化酶體：FAD將從脂肪酸等底物獲得的電子交給O2生成H2O2和羥自由基·OH。胞漿需氧脫氫酶（如黃嘌呤氧化酶等）也可催化生成O·-2。細菌感染、組織缺氧等病理過程，環(huán)境、藥物等外源因素也可導致細

27、胞產生活性氧類。,需氧脫氫酶和氧化酶,抗氧化酶體系,1、過氧化氫酶(catalase)又稱觸酶，其輔基含4個血紅素,可去除細胞生長和代謝產生的H2O2和過氧化物(R-O-OH)，是體內防止活性氧類損傷主要的酶。,2、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GPx),H2O2 + 2GSH → 2 H2O +GS-SG2GSH + R-O-OH → GS-SG + H2O + R-OH,谷胱甘肽過氧化物酶,

28、H2O2(ROOH),H2O(ROH+H2O),2G –SH,G –S – S – G,NADP+,NADPH+H+,,,,,此類酶可保護生物膜及血紅蛋白免遭損傷。,谷胱甘肽還原酶,含硒的谷胱甘肽過氧化物酶,,3、超氧化物歧化酶,2O2﹣+ 2H+,,SOD,H2O2 + O2,H2O + O2,過氧化氫酶,SOD：超氧化物歧化酶 (superoxide dismutase),,二、微粒體細胞色素P450單加氧酶催化底物分子羥基化