發(fā)酵技術生物工程

1、發(fā)酵技術在生物工程中的應用,,補加前體DL-蛋氨酸對S-腺苷-L-蛋氨酸發(fā)酵的影響,制作人：,制作班級:,從廣義上講，發(fā)酵工程由三部分組成： 1：上游工程 2：中游工程 3：下游工程,上游工程包括： 優(yōu)良種株的選育 最適發(fā)酵條件（pH、溫度、溶氧和營養(yǎng)組成）的確定 營養(yǎng)物的準備,中游工程包括：發(fā)酵開始前用高溫高壓對發(fā)酵原料和發(fā)酵罐及各種連接管道進行滅菌的技術；在發(fā)酵過程中不斷向發(fā)酵罐中通入干燥無菌空氣的

2、空氣過濾技術；在發(fā)酵過程中根據(jù)細胞生長要求控制加料速度的計算機控制技術；種子培養(yǎng)和生產(chǎn)培養(yǎng)的不同的工藝技術。發(fā)酵工藝上批量發(fā)酵，流加批量發(fā)酵，連續(xù)發(fā)酵的選擇。,下游工程包括： 固液分離技術（離心分離，過濾分離，沉淀分離等工藝） 細胞破壁技術（超聲、高壓剪切、滲透壓、表面活性劑和溶壁酶） 蛋白質純化技術（沉淀法、色譜分離法和超濾法等） 產(chǎn)品的包裝處理技術（真空干燥和冰凍干燥等）,補加前體DL-蛋氨酸對S-腺苷-

3、L-蛋氨酸發(fā)酵的影響,S-腺苷-L-蛋氨酸(簡稱SAM)是一種廣泛存在于活體細胞內的生物小分子,可由ATP:蛋氨酸腺苷轉移酶( MAT) 催化等分子的L-蛋氨酸和ATP合成得到。SAM是甲硫鍵型高能化合物,是生物體內一種重要的生理活性物質和中間代謝物質,具有轉甲基、轉氨丙基和轉硫等多種生理生化功能。細胞內SAM 濃度的微小改變,便會對細胞的生長、分化和功能產(chǎn)生重大影響。,SAM 的用途： 在生物學上具有多種生理作用,主要用于抗抑郁

4、、肝病治療、關節(jié)炎和偏頭痛治療,此外還具有食品營養(yǎng)強化劑等功能。SAM功能的多元性和無副作用,決定了其應用的廣泛性和長期使用性。1999 年美國FDA正式批準上市后,SAM迅速成為暢銷的營養(yǎng)保健品之一,年銷售額超過十億美元。它在國際市場和國內市場的需求不斷增長。近年來,國外的SAM臨床應用已轉向對肝臟疾患的治療。據(jù)報道,SAM不僅利于各種急、慢性肝病的治療,而且對實驗性動物早期肝癌也具有預防作用,有望成為肝病治療的理想藥物。我國是肝病大

5、國,肝病患者眾多,目前國內銷售的SAM 粉針劑(思美泰)是主要的護肝產(chǎn)品之一,長期依賴進口,價格昂貴,臨床使用受到很大的限制。因此,對SAM的生產(chǎn)工藝研究是國內當前急需解決的問題。,通過補加前體提高釀酒酵母SAM-J5E-4 發(fā)酵生產(chǎn)S-腺苷-L-蛋氨酸的水平。采用10 L 罐發(fā)酵, 考察在相同的培養(yǎng)條件下, 補加不同類型的蛋氨酸前體對S-腺苷-L-蛋氨酸合成的影響。,不補加前體蛋氨酸的發(fā)酵結果補加前體L-蛋氨酸的發(fā)酵結果補加前體D

6、-蛋氨酸的發(fā)酵結果補加前體DL-蛋氨酸的發(fā)酵結果,不補加前體蛋氨酸的發(fā)酵結果圖1, 2 為不補加前體蛋氨酸時SAM 的發(fā)酵過程曲線,圖1 􀀁 未補加前體蛋氨酸的細胞生長和SAM 發(fā)酵結果,圖2 􀀁 未補加前體蛋氨酸的發(fā)酵過程中葡萄糖和乙醇質量濃度變化曲線,分析：由于SAM 的合成是一個高能耗的過程, 每生成一分子的SAM 需要消耗36 分子ATP, 僅靠葡萄糖消耗產(chǎn)生的ATP 能量無法實現(xiàn)高密

7、度積累SAM. 結果表明, 在未補加前體蛋氨酸的條件下, SAM 的積累量增長很慢, 最高為0. 38 g/ L, 生物量最高為128 g/ L,在發(fā)酵結束前, 容易積累較高濃度的乙醇。,補加前體L-蛋氨酸的發(fā)酵結果在生物量達到80 g/ L 時, 開始流加L-蛋氨酸前體, 流加速率為2 g/ ( L . h) , 共流加5 h, 所得發(fā)酵結果見圖3, 4。,分析：由于合成一分子的SAM, 需要消耗一分子的蛋氨酸和一分子的ATP,

8、加入前體蛋氨酸, 可減少合成蛋氨酸所需的能量, 利于SAM 的高密度積累. 在補加前體L-蛋氨酸后, SAM 快速積累, 在開始流加16 h 后, SAM 積累量達到最高值, 為4. 66 g/ L, 蛋氨酸轉化率為17. 45% . 在生物量達到80 g/ L 后流加L-蛋氨酸, 可使生物量繼續(xù)增加, 最高達到147 g/ L,說明采用流加方式補加L-蛋氨酸, 并沒有對酵母細胞的生長產(chǎn)生明顯的抑制作用。,補加前體D-蛋氨酸的發(fā)酵結果

9、圖5, 6 為在生物量達到80 g/ L 時, 流加D-蛋氨酸前體的發(fā)酵結果, 流加速率為2 g/ ( L . h) , 共流加5 h.,圖5 􀀁 補加前體D-蛋氨酸對細胞生長和SAM合成的影響,分析：釀酒酵母的SAM 合成酶不能直接利用D-蛋氨酸. D-蛋氨酸被酵母細胞吸收后, 在胞內消旋酶的作用下, 部分D-蛋氨酸可被轉化成L-蛋氨酸, 為SAM 合成提供前體. 發(fā)酵結果表明, 流加前體D-蛋氨酸, SAM 的積

10、累量最高為1. 53 g/ L, 僅為流加L-蛋氨酸前體時SAM 積累量的1/ 3, 蛋氨酸轉化率為5. 73%. 而生物量最高達到124 g/ L, 表明通過流加方式補加D-蛋氨酸對酵母細胞生長的抑制作用并不明顯。,補加前體DL-蛋氨酸的發(fā)酵結果圖7, 8 為在生物量達到80 g/ L 時流加DL-蛋氨酸前體的發(fā)酵結果, 補加速率為4 g/ ( L . h) , 共流加5 h.,分析：在補加2 倍量的DL-蛋氨酸前體條件下,釀酒

11、酵母先利用L-蛋氨酸前體合成SAM, 同時D-蛋氨酸在酵母細胞內消旋酶的作用下轉化為L-蛋氨酸, 有效補充了合成SAM 的前體, 從而更利SAM 的積累, SAM 的積累量最高為5. 28 g / L, 蛋氨酸的轉化率為9. 88% . 在該前體流加策略下, 生物量最高達131 g/ L, 表明流加2 倍量的DL-蛋氨酸對酵母細胞的生長無影響.,結論：本實驗分別以L-蛋氨酸、D-蛋氨酸和DL-蛋氨酸作為發(fā)酵前體, 考察了補加不同類型的

12、蛋氨酸前體對細胞生長和SAM 積累的影響. 當發(fā)酵過程中以2 g / ( L . h) 的速率流加D-蛋氨酸前體時, SAM 的積累量為1. 53 g/ L, 生物量達124 g/ L; 以相同速率流加前體L-蛋氨酸時,SAM 的積累量達4.68 g/ L,生物量為146 g / L。相比較而言,采用4 g/ ( L .h) 的速率流加DL-蛋氨酸前體時, SAM 的積累量最高,可達5. 28 g/ L, 生物量為128 g / L,