dgge微生物工程

1、綜述題目：綜述題目：DGGETGGEDGGETGGE技術的原理及應用技術的原理及應用1.1變性梯度凝膠電泳、溫度梯度凝膠電泳基本原理原理1.11發(fā)展歷史DGGE技術是由Fischer和Lerman于1979年最先提出的用于檢測DNA突變的一種電泳技術。它的分辨精度比瓊脂糖電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳更高可以檢測到一個核苷酸水平的差異。Muyzer[1]等人在1993年首次將其應用于微生物群落結構研究。后來又發(fā)展出其衍生技術，溫度梯度凝膠電泳

2、（temperaturegradientgelelectrophesis，TGGE）。此后十年間，該技術被廣泛用于微生物分子生態(tài)學研究的各個領域，目前已經發(fā)展成為研究微生物群落結構的主要分子生物學方法之一。1.12基本原理雙鏈DNA分子在一般的聚丙烯酰胺凝膠電泳時，其遷移行為決定于其分子大小和電荷。不同長度的DNA片段能夠被區(qū)分開，但同樣長度的DNA片段在膠中的遷移行為一樣，因此不能被區(qū)分。DGGETGGE技術在一般的聚丙烯酰胺凝膠基礎

3、上，加入了變性劑（尿素和甲酰胺）梯度或是溫度梯度，從而能夠把同樣長度但序列不同的DNA片段區(qū)分開來。一個特定的DNA片段有其特有的序列組成，其序列組成決定了其解鏈區(qū)域(meltingdomainMD)和解鏈行為(meltingbehavi)。一個幾百個堿基對的DNA片段一般有幾個解鏈區(qū)域，每個解鏈區(qū)域有一段連續(xù)的堿基對組成。當溫度逐漸升高（或是變性劑濃度逐漸增加）達到其最低的解鏈區(qū)域溫度時，該區(qū)域這一段連續(xù)的堿基對發(fā)生解鏈。當溫度再高依

4、次達到各其他解鏈區(qū)域溫度時，這些區(qū)域也依次發(fā)生解鏈。直到溫度達到最高的解鏈區(qū)域溫度后，最高的解鏈區(qū)域也發(fā)生解鏈，從而雙鏈DNA完全解鏈。不同的雙鏈DNA片段因為其序列組成不一樣，所以其解鏈區(qū)域及各解鏈區(qū)域的解鏈溫度也是不一樣的。當它們進行DGGETGGE時，一開始溫度（或變性劑濃度）比較小，不能使雙鏈DNA片段最低的解鏈區(qū)域解鏈，此時DNA片段的遷移行為和在一般的聚丙烯酰胺凝膠中一樣。然而一旦DNA片段遷移到一特定位置，其溫度（或變性劑

5、濃度）剛好能使雙鏈DNA片段最低的解鏈區(qū)域解鏈時，雙鏈DNA片段最低的解鏈區(qū)域立即發(fā)生解鏈。部分解鏈的DNA片段在膠中的遷移速率會急劇降低。因此，同樣長度但序列不同的DNA片段會在膠中不同位置處達到各自最低解鏈區(qū)域的解鏈溫度，因此它們會在膠中的不同位置處發(fā)生部分解鏈導致遷移速率大大下降，從而在膠中被區(qū)分開來。1.13操作過程該技術主要包括以下步驟:①樣品的采集②樣品總DNA提取及純化③樣品16SrDNA片段的PCR擴增④預實驗(主要是對