球孢白僵菌適應環(huán)境pH變化及胞內(nèi)pH穩(wěn)態(tài)維持的遺傳分子基礎及其對生物防治潛能的貢獻.pdf

1、球孢白僵菌(Beauveria bassiana)是廣泛用于農(nóng)林害蟲生物防治的一種絲狀昆蟲病原真菌，其生物防治潛能不僅取決于毒力，而且取決于抗逆境能力?；铙w真菌制劑在田間應用時，不可避免地會暴露在各種類型的環(huán)境脅迫之下，如田間高溫、紫外輻射、化學農(nóng)藥及土壤酸堿度等，這些都是影響菌劑殺蟲效果和穩(wěn)定性的重要因素。真菌許多重要的生命活動受環(huán)境pH的調(diào)控，而且細胞內(nèi)pH穩(wěn)態(tài)的維持對病原真菌的生長發(fā)育及致病性至關重要。本論文圍繞球孢白僵菌如何適應

2、環(huán)境pH變化這一主題，研究和解析了Pal信號通路的7個蛋白、Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白Nhx1及液泡ATP激酶H亞基VmaH的生物學功能，重點揭示它們編碼的基因?qū)η蜴甙捉┥锓乐螡撃艿呢暙I。主要研究內(nèi)容和結果簡述如下:
　　Pal信號通路依賴pH調(diào)控球孢白僵菌的生長發(fā)育及高滲應答絲狀真菌適應環(huán)境pH的變化主要受控于Pal信號通路。在球孢白僵菌中，Pal通路由轉(zhuǎn)錄因子PacC及上游六個Pal蛋白(PalA/B/C/F/H/I)組成。編

3、碼這些蛋白的所有基因在pH9的堿性條件下轉(zhuǎn)錄表達水平最高。pacC及各pal的單基因敲除株在初始pH7.3的環(huán)境的培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)基的酸化顯著延遲，并伴隨著胞內(nèi)外有機酸含量的改變。在堿性條件下的NaCl、KC1、LiCl或山梨醇的高滲脅迫條件下，除△palI之外所有敲除株的生長受到顯著抑制，而且堿性環(huán)境的高滲脅迫使其菌絲細胞內(nèi)的液泡發(fā)生碎裂和形態(tài)的改變，即形成不規(guī)則的碎片狀液泡。所有敲除株在pH3條件下的分生孢子產(chǎn)量高于野生株，大多數(shù)敲

4、除株在pH7條件下的產(chǎn)孢量高于野生株，但在pH9下的產(chǎn)孢量卻低于野生株，并且在pH9條件下所產(chǎn)分生孢子的大小和密度發(fā)生改變。所有敲除株對大蠟螟幼蟲的毒力都有所降低。結果表明，Pal信號通路以依賴pH的方式調(diào)控球孢白僵菌的營養(yǎng)生長，產(chǎn)孢及高滲敏感性，而且對其毒力有顯著貢獻。
　　球孢白僵菌Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白Nhx1的功能解析球孢白僵菌胞內(nèi)只有一個NHE家族成員，即Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白Nhx1，對其的研究在絲狀真菌中罕見報道

5、。將nhx1與eGFP融合后在野生菌株中表達，并利用熒光顯微鏡觀察可見融合蛋白分布在菌絲細胞隔膜和管狀液泡之間的點狀結構上，但確定不定位于液泡中。根據(jù)釀酒酵母Nhx1與其特殊細胞器上的標記蛋白共定位的研究報道推測，上述點狀結構可能是類似酵母細胞內(nèi)的小體和跨高爾基體網(wǎng)絡。nhx1的缺失導致胞內(nèi)液泡酸化和液泡整合受阻或裂解加劇，表現(xiàn)為菌絲細胞內(nèi)形成很多小而不規(guī)則的液泡;而野生菌株胞內(nèi)液泡呈球狀或管狀，既大且少。敲除株的氣生分生孢子和液生芽生

6、孢子的產(chǎn)量劇幅下降。其分生孢子在不同碳氮源的基礎培養(yǎng)基和富營養(yǎng)培養(yǎng)基上的萌發(fā)速率較為緩慢，并且其菌落生長也表現(xiàn)出不同程度的缺陷。敲除株對高滲、高溫及部分金屬離子脅迫的敏感性升高，但分生孢子抗UV-B輻射的能力卻顯著增強。令人感興趣的是，敲除株不能經(jīng)昆蟲體壁或血腔注射侵染大蠟螟幼蟲，即其致病力完全喪失。進一步研究發(fā)現(xiàn)，敲除株在培養(yǎng)期間分泌至胞外的體壁降解酶的活力大幅下降;注射到昆蟲血腔的分生孢子不能形成芽生孢子。敲除株所有的這些變化在回補

7、株中均得到恢復。研究結果表明，Nhx1不僅參與調(diào)節(jié)液泡內(nèi)pH平衡和液泡的形態(tài)，而且也是球孢白僵菌在昆蟲體外或體內(nèi)的無性循環(huán)所必不可少的。
　　球孢白僵菌液泡ATP激酶亞基H的功能解析VmaH是真菌液泡ATP激酶復合體的眾多亞基之一。將球孢白僵菌的vmaH同源基因與綠色熒光蛋白基因eGFP融合并轉(zhuǎn)入野生株中表達后，證明VmaH定位于細胞質(zhì)而不是液泡中。vmaH的缺失導致菌絲液泡內(nèi)pH顯著上升，而培養(yǎng)液的酸化加快，并伴隨分泌到胞外的氨

8、含量急劇下降87％。由于細胞內(nèi)外pH的失衡，敲除株在不同碳氮源的基礎培養(yǎng)基和富營養(yǎng)培養(yǎng)基上，從酸性至中性條件下的生長有不同程度缺陷，但在堿性條件下生長缺陷縮小。敲除株在正常培養(yǎng)條件下的產(chǎn)孢大幅延遲，但最終產(chǎn)孢量僅下降10％左右;液體培養(yǎng)的芽生孢子產(chǎn)量顯著下降，并且所產(chǎn)氣生分生孢子和液生芽生孢子的形態(tài)大小和密度也發(fā)生顯著變化。敲除株對大蠟螟幼蟲的毒力顯著下降，而且經(jīng)體壁侵染的毒力降幅大于經(jīng)血腔注射侵染的毒力降幅，其分生孢子耐高溫、抗紫外輻