重寄生真菌盾殼霉感應(yīng)環(huán)境pH值的分子機制及其對生防效果影響的研究.pdf

1、核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum）引起的油菜菌核病是一種世界性分布的重要病害。盾殼霉（Coniothyrium minitans）是核盤菌的一種重寄生真菌，對油菜菌核病生物防治而言具有廣闊的應(yīng)用前景。前人研究已經(jīng)報道，核盤菌能夠分泌草酸酸化環(huán)境pH，盾殼霉在酸化pH下能夠合成抗真菌物質(zhì)(AFS)，抑制核盤菌菌絲生長和菌核萌發(fā)。另一方面，盾殼霉具有降解草酸的能力，使環(huán)境pH值上升，從而提高盾殼霉產(chǎn)生重寄生相關(guān)細(xì)胞壁

2、降解酶量及活性。這些結(jié)果表明環(huán)境pH在盾殼霉與核盤菌的互作過程中扮演重要角色。前期研究已經(jīng)從盾殼霉中獲得了pacC/Rim101的同源基因CmpacC，但對于CmpacC基因的功能及pH感應(yīng)調(diào)控系統(tǒng)中的其它基因尚不清楚。針對這些問題，本研究采用原生質(zhì)PEG介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的基因敲除和互補技術(shù)分別對CmpacC，以及pH感應(yīng)信號途徑(Pal)中相關(guān)基因CmpalA、CmpalB、CmpalC、CmpalF、CmpalH和CmpalI等進(jìn)行了功能分

3、析，并對這些基因在盾殼霉重寄生、降解草酸和產(chǎn)生抗真菌物質(zhì)中的作用進(jìn)行了分析，取得的如下研究結(jié)果:
　　第一，明確了核心轉(zhuǎn)錄因子CmpacC對盾殼霉菌絲發(fā)育以及感應(yīng)胞外高鹽高滲壓力能力的影響。目前通過原生質(zhì)體PEG介導(dǎo)轉(zhuǎn)化技術(shù)已經(jīng)獲得CmpacC基因的敲除轉(zhuǎn)化子（△CmpacC-21、△CmpacC-29、△CmpacC-46）以及互補轉(zhuǎn)化子（△CmpacC-29C）。與野生型菌株Chy-1相比較，△CmpacC-29突變體在弱酸性

4、或者堿性pH下的菌絲生長受到顯著抑制，同時△CmpacC-29突變體的產(chǎn)孢量也顯著降低。另外，CmpacC的敲除使得盾殼霉對胞外高鹽高滲壓力也更為敏感，但是對于胞外的重金屬離子和過氧壓力卻沒有明顯的區(qū)別，由此也可以看出CmpacC在盾殼霉對高鹽高滲壓力的抗性方面起著重要的調(diào)控作用。
　　第二，明確核心轉(zhuǎn)錄因子CmpacC在pH感應(yīng)調(diào)控系統(tǒng)中對盾殼霉寄生核盤菌、降解草酸的能力以及抗真菌活性的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制。通過比較△CmpacC-29

5、突變體與野生型菌株Chy-1和互補轉(zhuǎn)化子△CmpacC-29C對核盤菌的重寄生能力、降解草酸鹽的能力以及抗真菌活性。結(jié)果顯示:與野生型菌株Chy-1和△CmpacC-29C相比，△CmpacC-29突變體對核盤菌菌絲和菌核的重寄生能力明顯降低，但是△CmpacC-29突變體降解草酸鹽的能力以及產(chǎn)抗真菌物質(zhì)的能力顯著增強。為了闡釋△CmpacC-29突變體如何影響盾殼霉寄生核盤菌的能力、降解草酸鹽的能力以及產(chǎn)抗真菌的能力，我們通過熒光定量

6、PCR以及酶活試驗，表明△CmpacC-29突變體的β-1，3-葡聚糖酶、幾丁質(zhì)酶以及蛋白酶基因的表達(dá)量，以及相對應(yīng)酶的活性顯著低于野生型Chy-1和互補轉(zhuǎn)化子△CmpacC-29C，但是△CmpacC-29突變體的Cmoxdc1的表達(dá)量以及總的草酸脫羧酶的活性顯著高于野生型Chy-1和互補轉(zhuǎn)化子△CmpacC-29C。酵母轉(zhuǎn)錄激活試驗以及EMSA試驗結(jié)果進(jìn)一步證實了CmpacC是一種轉(zhuǎn)錄因子，可以直接與Cmg1、Cmch1以及Cmox

7、dc1的啟動子序列中的保守結(jié)合位點（GCCARG）結(jié)合。由此可以推出CmpacC正調(diào)控著盾殼霉對核盤菌的寄生，但同時也負(fù)調(diào)控著草酸鹽降解以及抗真菌的活性。
　　第三，從盾殼霉野生型菌株Chy-1中克隆得到了5個Pal基因同源物，即CmpalA（GenBank登錄號:KP747602）、CmpalB（GenBank登錄號:KP747603）、CmpalC（GenBank登錄號:KP747604）、CmpalF(GenBank登錄號:

8、KP747605)、CmpalH（GenBank登錄號:KP747606）和CmpalI（GenBank登錄號:KP747607）。系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果顯示:CmpalA、CmpalC、CmpalF和CmpalH與油菜黑脛病菌（Leptosphaeriamaculans中的同源基因親緣關(guān)系最近，而CmpalB與小麥褐斑病菌（Pyrenophoratritici-repentis）的PalB親緣關(guān)系最近，CmpalI與小麥葉枯病菌（Phaeo

9、sphaeria nodorum）的Pal1親緣關(guān)系最近。
　　第四，通過原生質(zhì)體PEG介導(dǎo)轉(zhuǎn)化技術(shù)成功獲得了CmpalA、CmpalB、CmpalC、CmpalF和CmpalH等5個基因的敲除轉(zhuǎn)化子，分別命名為△CmpalA-33、△CmpalB-13、△CmpalC-5、△CmpalF-50和△CmpalH-26。CmpalI基因的敲除轉(zhuǎn)化子目前仍然沒有獲得。與野生型菌株Chy-1相比較，在pH＞6的條件下，突變體△Cmpal

10、A-33、△CmpalB-13、△CmpalC-5、△CmpalF-50和△CmpalH-26菌株生長明顯受到抑制，說明缺失這些基因使得盾殼霉對堿性pH值環(huán)境更加敏感。基因表達(dá)量分析結(jié)果顯示:在這些突變體中，核心轉(zhuǎn)錄因子CmpacC的表達(dá)量非常低?？赡艿脑蛟谟?CmpalA、CmpalB、CmpalC、CmpalF和CmpalH等5個基因位于CmpacC的上游，敲除這些基因可能阻斷CmpacC編碼產(chǎn)物的剪切，使得CmpacC蛋白無法進(jìn)

11、入細(xì)胞核中調(diào)控自身表達(dá)。
　　第五，明確了CmpalA、CmpalB、CmpalC、CmpalF和CmpalH對盾殼霉重寄生作用以及抗真菌作用的影響。在重寄生作用方面，對峙培養(yǎng)試驗結(jié)果表明:與野生型菌株Chy-1相比較，菌株△CmpalA-33、△CmpalB-13和△CmpalC-5寄生核盤菌菌絲能力顯著降低，而菌株△CmpalF-50、△CmpalH-26寄生核盤菌菌絲的能力沒有明顯變化。但是，菌株△CmpalA-33、△Cm

12、palB-13、△CmpalC-5、△CmpalF-50和△CmpalH-26寄生核盤菌菌核的能力均有顯著降低?？拐婢饔脺y定結(jié)果表明:MCD為基本培養(yǎng)基，菌株△CmpalA-33、△CmpalB-13、△CmpalC-5、△CmpalF-50、△CmpalH-26在pH8的條件下培養(yǎng)時，培養(yǎng)濾液抑制核盤菌菌絲生長的效果顯著高于野生型菌株Chy-1。原因可能在于菌株△CmpalA-33、△CmpalB-13、△CmpalC-5、△Cmp

13、alF-50和△CmpalH-26中核心轉(zhuǎn)錄因子CmpacC表達(dá)量太低，使其不能抑制抗真菌作用相關(guān)基因的表達(dá)。
　　根據(jù)上述試驗結(jié)果，可以看出:CmpacC及其Pal信號通路基因在盾殼霉與核盤菌的互作中扮演重要角色。在盾殼霉與核盤菌互作的早期，核盤菌在菌絲生長的同時會分泌草酸，從而為自身菌絲的生長創(chuàng)造酸性的環(huán)境，盾殼霉在酸性的環(huán)境條件下會分泌草酸脫羧酶來降解草酸，隨著草酸的降解，環(huán)境的pH值會隨之增高。隨著環(huán)境pH的升高，盾殼霉菌