球孢白僵菌Ras大家族中八個(gè)小G蛋白的功能解析及其對(duì)生物防治潛能的貢獻(xiàn).pdf

1、球孢白僵菌(Beauveria bassiana)是用于農(nóng)林害蟲(chóng)生物防治的經(jīng)典昆蟲(chóng)病原真菌，其生防潛能取決于常見(jiàn)侵染體分生孢子的產(chǎn)量、質(zhì)量、對(duì)靶標(biāo)害蟲(chóng)的毒力及抗逆力等諸多性狀。這些生防潛能相關(guān)性狀與若干細(xì)胞生物學(xué)事件密切相關(guān)，如孢子萌發(fā)、營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)、孢子形成、多脅迫應(yīng)答及寄主侵染等。真核生物的Ras小GTP酶大家族成員都可作為分子開(kāi)關(guān)，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、凋亡、基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞骨架重組等系列細(xì)胞活動(dòng)，但昆蟲(chóng)病原真菌的絕大多數(shù)成員尚無(wú)相關(guān)研究

2、報(bào)道。本文通過(guò)構(gòu)建和分析單基因敲除/回補(bǔ)菌株和正或負(fù)顯性點(diǎn)突變菌株，研究解析球孢白僵菌Miro、Ras3和6個(gè)Rho小GTP酶調(diào)節(jié)或參與調(diào)節(jié)的生物學(xué)功能及其對(duì)球孢白僵茵生防潛能的貢獻(xiàn)。主要結(jié)果摘要如下。
　　球孢白僵菌小GTP酶Miro調(diào)控對(duì)脅迫耐受性和毒力至關(guān)重要的線粒體分布和流動(dòng)性Miro同源蛋白是真核細(xì)胞中廣泛存在的一類線粒體靶向的小G蛋白，屬于Ras小GTP酶大家族，但在絲狀真菌中的研究報(bào)道幾近空白。球孢白僵菌中存在唯一的

3、Miio同源蛋白bMiro，通過(guò)整體、截頭或去尾的亞細(xì)胞定位研究，證明bMiro在線粒體外膜上的亞細(xì)胞定位完全依賴于其C末端45個(gè)氨基酸殘基組成的跨膜結(jié)構(gòu)域(TMD)。bMiro的功能缺失導(dǎo)致菌絲細(xì)胞中線粒體的聚集分布、總量減少及流動(dòng)性降低，以致胞內(nèi)ATP含量大幅下降，但并不致線粒體的形態(tài)發(fā)生變化。在限制性培養(yǎng)基上，敲除株Δbmiro對(duì)Ca2+、Mn2+、Zn2+和Mg2+的耐受力較野生株分別提高42％、37％、19％及10％。此外，敲

4、除株的重要表型出現(xiàn)不同程度的缺陷，如孢子萌發(fā)緩慢，營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)較弱，分生孢子耐高溫、抗紫外輻射的能力及毒力下降，但對(duì)氧化和高滲脅迫無(wú)顯著應(yīng)答反應(yīng)。所有表型變化都在回補(bǔ)株中恢復(fù)到野生株的水平。結(jié)果表明，球孢白僵菌bMiro調(diào)控的線粒體分布及運(yùn)動(dòng)是ATP釋放能量運(yùn)輸金屬離子所必須的，因而對(duì)球孢白僵菌的生防潛能具有顯著貢獻(xiàn)。
　　新的Ras小GTP酶Ras3在Hog1信號(hào)通路上游發(fā)揮作用從而調(diào)控球孢白僵菌的產(chǎn)孢、多脅迫應(yīng)答及毒力真菌中關(guān)于R

5、as1和Ras2兩個(gè)Ras小GTP酶協(xié)作或反向調(diào)節(jié)若干細(xì)胞事件的研究報(bào)道很多，罕見(jiàn)有第三個(gè)Ras蛋白存在的報(bào)道。本研究證明球孢白僵菌和許多其他絲狀真菌中存在另一個(gè)Ras同源蛋白即Ras3。生物信息學(xué)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析顯示，絲狀真菌中的Ras3擁有Ras家族典型的5個(gè)結(jié)構(gòu)域和兩個(gè)GTP/GDP開(kāi)關(guān)，只是Ras3蛋白C末端通常與膜定位相關(guān)的CAAX基序中半胱氨酸的位置從倒數(shù)第四位移至倒數(shù)第二位，但這一位移被證明并不影響其在球孢白僵菌細(xì)胞質(zhì)膜上的定

6、位。在球孢白僵菌中，ras3的缺失導(dǎo)致ras1在野生株中的轉(zhuǎn)錄水平隨培養(yǎng)時(shí)間而顯著改變，但對(duì)ras2的轉(zhuǎn)錄表達(dá)影響不大。與野生株相比，ras3敲除株在富營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)顯著加快，但在一些不同碳氮源貧瘠培養(yǎng)基上菌落生長(zhǎng)速率有所減慢。正常培養(yǎng)條件下，敲除株分生孢子產(chǎn)量顯著降低，所產(chǎn)孢子耐高溫、抗紫外能力及毒力顯著下降。此外，敲除株對(duì)甲萘醌氧化脅迫的敏感性遠(yuǎn)高于對(duì)H2O2的氧化脅迫，對(duì)高滲脅迫的敏感性遠(yuǎn)高于胞壁干擾脅迫。敲除株對(duì)甲萘醌的高敏

7、感性吻合超氧化物歧化酶基因轉(zhuǎn)錄水平及總酶活的顯著下降，而高滲敏感性不僅吻合高滲甘油(HOG)信號(hào)通路中多數(shù)信號(hào)蛋白及關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Msn2的轉(zhuǎn)錄表達(dá)劇烈下調(diào)，而且吻合幾乎檢測(cè)不出的標(biāo)志性激酶Hog1的表達(dá)及磷酸化信號(hào)。所有這些變化都因ras3的回補(bǔ)而修復(fù)。結(jié)果表明，Ras3在HOG信號(hào)通路上游扮演重要角色從而調(diào)節(jié)球孢白僵菌的產(chǎn)孢、多脅迫應(yīng)答及毒力，因而是其適應(yīng)眾多昆蟲(chóng)寄主及復(fù)雜多樣環(huán)境所必需的。
　　球孢白僵菌Rho家族六個(gè)小G蛋白

8、的功能解析球孢白僵菌Rho家族由六個(gè)小G蛋白組成，其中四個(gè)的編碼基因(rho2、rho3、rho4及cdc42)分別被成功敲除和回補(bǔ)，而另兩個(gè)的編碼基因(rho1及racA)是敲除致死的，通過(guò)各自的正顯性(DA)和負(fù)顯性(DN)點(diǎn)突變而構(gòu)建突變株D Arho1、DNrho1、DAracA及DNracA。在這些敲除株和點(diǎn)突變株中，DNrho1、Δrho4及Δcdc42在富營(yíng)養(yǎng)和不同碳氮源的貧瘠營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上一致表現(xiàn)出或輕或重的生長(zhǎng)缺陷。其中

9、，DNrho1孢子萌發(fā)大幅延遲，菌絲增粗、隔膜增多，細(xì)胞變短;Δrho4菌絲常在隔膜處斷裂成細(xì)管狀無(wú)隔單細(xì)胞，以單一或分叉出芽的方式在其一端形成一或二個(gè)橢圓狀細(xì)胞，顯示其極性生長(zhǎng)嚴(yán)重受阻，因而生長(zhǎng)缺陷最嚴(yán)重。Δcdc42菌絲形態(tài)變化不大，但尖端細(xì)胞延長(zhǎng)而使極性生長(zhǎng)異常。DNrho1的產(chǎn)孢缺陷嚴(yán)重，Δcdc42次之。其余敲除株或點(diǎn)突變株沒(méi)有明顯的生長(zhǎng)、產(chǎn)孢和萌發(fā)異常。在金屬離子脅迫實(shí)驗(yàn)中，只有Cu2+的敏感性在Δrho2、Δrho4、DA

10、rho1、DNrho1及DNracA中顯著升高，而所有敲除株及點(diǎn)突變株對(duì)Mn2+、Ca2+、Fe2+、Mg2+、Zn2+等金屬離子脅迫都表現(xiàn)為抗性增強(qiáng)或無(wú)顯著反應(yīng)。在化學(xué)脅迫實(shí)驗(yàn)中，只有Δrho4對(duì)氧化脅迫更加敏感，而其余敲除株及點(diǎn)突變株或更抗胞壁干擾及氧化脅迫，或?qū)@些及高滲脅迫無(wú)顯著反應(yīng)。除Δrho2和Δrho3之外的敲除株及點(diǎn)突變株在菌落生長(zhǎng)期間對(duì)高溫?zé)峒ぷ兠舾?，除Δrho4之外所有敲除株及點(diǎn)突變株的分生孢子對(duì)UV-B紫外輻射更敏