模擬昆蟲(chóng)中腸環(huán)境對(duì)球孢白僵菌孢子的影響.pdf

1、作為重要的昆蟲(chóng)病原真菌,球孢白僵菌(Beauveria bassiana)很難通過(guò)口器攝入經(jīng)腸壁侵染寄主,但其機(jī)理不明。本研究首先篩選出一株穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白的球孢白僵菌遺傳轉(zhuǎn)化菌株,然后模擬昆蟲(chóng)中腸環(huán)境處理其兩種孢子,采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)處理后孢子熒光強(qiáng)度的變化以反映孢壁的受損程度,并用掃描電子顯微鏡觀測(cè)處理后孢壁表面形態(tài),最后測(cè)定處理后兩種孢子的萌發(fā)率以反映對(duì)孢子活力的影響。主要內(nèi)容和結(jié)果分述于下： 遺傳轉(zhuǎn)化菌株的生物學(xué)篩選

2、從六個(gè)轉(zhuǎn)化子菌株中篩選出能代表野生型菌株生理生化特征的高效表達(dá)綠色熒光蛋白的菌株。測(cè)定六個(gè)轉(zhuǎn)化子菌株的分生孢子熒光強(qiáng)度強(qiáng)弱,結(jié)果顯示Bb2860G6是最優(yōu)的熒光強(qiáng)度最強(qiáng)的菌株。耐熱力測(cè)定結(jié)果顯示,菌株Bb2860G6、Bb2860G12和Bb2860G4在熱脅迫后的殘存活孢率均在55％以上,孢子耐熱力極強(qiáng)。測(cè)定Bb2860G0、Bb2860G1、Bb2860G6和Bb2860G8四個(gè)菌株的菌落生長(zhǎng)情況,Bb2860G1的菌落面積顯著較低

3、,其他三個(gè)菌落面積差異不顯著。用Bb2860G0、Bb2860G6和Bb2860G8這三株菌進(jìn)行對(duì)桃蚜的生物測(cè)定,結(jié)果表明三個(gè)菌株的孢子懸液對(duì)桃蚜的劑量效應(yīng)與時(shí)間效應(yīng)都極顯著,Bb2860G6與Bb2860G0的時(shí)間效應(yīng)值接近,殺蚜效應(yīng)接近。綜合各項(xiàng)生物學(xué)篩選指標(biāo),最終選取Bb2860G6菌株為最終的研究對(duì)象。 模擬昆蟲(chóng)中腸環(huán)境對(duì)分生孢子的影晌配置單一或者復(fù)合的模擬昆蟲(chóng)中腸消化液,使Bb2860G6分生孢子懸浮于其中,恒溫水浴后

4、,采用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定其熒光強(qiáng)度的變化情況,結(jié)果顯示：不同濃度的蛋白酶K、胰蛋白酶、鏈霉蛋白酶E、纖維素酶處理后均引起被檢熒光強(qiáng)度的上升,并呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。α-淀粉酶、蝸牛酶、葡萄糖苷酶、昆布多糖酶處理組只引起被檢熒光強(qiáng)度的輕微變化,并呈現(xiàn)出下降趨勢(shì)。經(jīng)兩種復(fù)合酶模擬消化液處理后,兩種復(fù)合酶液均引起被檢熒光強(qiáng)度的下降,然而下降幅度有所差異：蛋白酶K和纖維素酶引起孢子熒光強(qiáng)度降低8％-21％,胰蛋白酶和纖維素酶導(dǎo)致37％-43％的下

5、降幅度。在pH 5-11范圍內(nèi),兩種復(fù)合酶液處理后孢子的相對(duì)熒光強(qiáng)度有所下降,分別為對(duì)照的53％-72％和77％-97％。電鏡照片顯示熒光強(qiáng)度上升的處理組孢子壁表面蛋白紋路模糊,孢壁變??；而熒光強(qiáng)度下降的處理組孢壁部分結(jié)構(gòu)不完整,甚至出現(xiàn)孔洞。 測(cè)定經(jīng)不同的模擬消化液處理后的分生孢子萌發(fā)率,結(jié)果顯示,單一酶模擬消化液處理后分生孢子萌發(fā)率出現(xiàn)不同程度的降低,胰蛋白酶引起萌發(fā)率下降幅度最大(31％)。pH5-11條件下用兩種復(fù)合酶模

6、擬消化液處理分生孢子,萌發(fā)率均出現(xiàn)大幅度的降低。胰蛋白酶和纖維素酶組合引起萌發(fā)率下降30-98％,蛋白酶K和纖維素酶組合引起萌發(fā)率下降21-91％。 模擬昆蟲(chóng)中腸環(huán)境對(duì)芽生孢子的影響采用同分生孢子相同的樣品處理方法,使模擬昆蟲(chóng)中腸消化液作用于Bb2860G6芽生孢子,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示：不同濃度的蛋白酶K、胰蛋白酶、鏈霉蛋白酶E、纖維素酶處理后均引起被檢熒光強(qiáng)度的上升,但隨濃度增大上升趨勢(shì)變化不明顯；經(jīng)昆布多糖酶和α-淀粉酶

7、處理后,熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)；而經(jīng)蝸牛酶、葡萄糖苷酶處理后,隨濃度升高被檢熒光強(qiáng)度呈下降趨勢(shì)。經(jīng)兩種復(fù)合酶模擬消化液處理后,胰蛋白酶和纖維素酶組合導(dǎo)致熒光強(qiáng)度上升8％-48％,隨酶液濃度的上升,熒光強(qiáng)度上升幅度增大；蛋白酶K和纖維素酶組合則隨酶液濃度上升熒光強(qiáng)度上升幅度減小(10％-3％),1％濃度甚至引起被檢熒光強(qiáng)度下降15％。在pH 5-11范圍內(nèi),兩種復(fù)合酶模擬消化液處理后孢子的相對(duì)熒光強(qiáng)度有所上升,分別為對(duì)照的2.14

8、-1.35倍和1.01-1.36倍。掃描電鏡觀測(cè)結(jié)果顯示蛋白酶處理后芽生孢子表面未出現(xiàn)明顯變化,而糖苷酶類(lèi)處理后孢子表面不再光滑平整,被消減而變得不平。 測(cè)定經(jīng)不同的酶液處理后的分生孢子萌發(fā)率,結(jié)果表明,單一酶模擬消化液處理后芽生孢子萌發(fā)率出現(xiàn)不同程度的降低。其中,昆布多糖酶引起萌發(fā)率下降幅度最大(30％)。pH5-11條件下胰蛋白酶和纖維素酶組合引起萌發(fā)率下降49-78％,蛋白酶K和纖維素酶引起萌發(fā)率下降43％-67％。