檢驗核醫(yī)學(xué)放射免疫分析和免疫放射分析

1、檢驗核醫(yī)學(xué),第五章 體外放射分析,概述,體外放射分析 體外放射分析是在體外條件下，以放射性標記物為示蹤劑，以結(jié)合反應(yīng)為基礎(chǔ)，以放射性測量為定量手段，在試管中進行的對體內(nèi)微量活性物質(zhì)進行定量分析的核技術(shù)的總稱。 放射性標記物：*Ag、*Ab、*L、*S 特異性結(jié)合劑：Ab、R、E 分析對象：血液(血清、血漿)、尿液、

2、 唾液、組織勻漿液、分離的組分,特點 1.靈敏度高 最小可測量為10-9-10-15g 2.特異性強 利用專一性強的結(jié)合反應(yīng) 3.精確度好 有效的質(zhì)量控制方法 4.放射性不引入體內(nèi) 5.所需待測樣品少 50-200?l 6.試劑藥盒化，操作簡便、快速 7.測量微機化，方便、快捷，客觀、準確,類型 競爭性體外放射分析

3、 標記物 結(jié)合劑 放射免疫分析 *Ag Ab (RIA)

4、 競爭蛋白結(jié)合分析 *Ag 血漿中固有的 (CPBA) 激素載體蛋白

5、 (TBG) 放射受體分析 *L R (RRA)

6、 放射酶分析 *S E (REA) 非競爭性體外放射分析 免疫放射分析 *Ab *Ab

7、 (IRMA) 受體的放射分析 *L R (RBA)

8、 酶的放射分析 *S E (ERA),放射免疫分析(RIA),基本原理1 RIA反應(yīng)式 分離劑 *Ag + Ab ? *Ag-Ab

9、 ? *Ag-Ab ? + 分離劑 Ag ? Ag-Ab ? Ag-Ab ?1)一定量*Ag 、不定量Ag與限量Ab進行競爭抑制結(jié)合反應(yīng)2) *Ag-Ab 與Ag成負相關(guān)關(guān)系(反比)3)在實際工作中，用一系列已知濃度的Ag(標準品)

10、進行實驗制備劑量反應(yīng)曲線(標準曲線， [*Ag-Ab] －[Ag]曲線)，未知樣品在相同條件下實驗，其濃度通過標準曲線查出,,2 RIA數(shù)學(xué)函數(shù)式 k1 Ag + Ab ? Ag-Ab

11、 k2 P + Q ? PQ P = [Ag] + [*Ag] P0 = [Ag0] + [*Ag0] Q = [Ab] Q0 = [Ab0] PQ = [Ag-Ab] + [*Ag-A

12、b] k1 [PQ] [PQ] K = —— = ———— = ——————— (1) k2 [P] [Q] [P] ([Q0]-[PQ]) [PQ]

13、 = ——————— (2) ([P0]-[PQ]) [Q],將B = [PQ] / [P0]、B / F = B / (1-B) = [PQ] / [P]代入(1) B 1 K = ——— × ——————— (3)

14、 展開重排 1 – B [Q0] - B [P0] [Q0] 1 [Q0] B2 – B (1 + ——— + ——— ) + ——— = 0 (4) [P0] K [P0]

15、 [P0] 將B = 1 - F代入(3) [Q0] 1 1 F2 – F (1 - ——— - ——— ) + ——— = 0 (5) [P0] K [P0] K [P0] 定義R = B / F，由

16、B + F = 1得B = R / (1+R)代入(3) R2 + R ( 1 + K [P0] – K [Q0] ) – K [Q0] = 0 (6),3 RIA劑量反應(yīng)曲線,4 方法流程 加樣→溫育→分離→測定→數(shù)據(jù)處理→ 簽發(fā)檢測報告,基本試劑 1標準抗原(Ag) 2標記抗原(*A

17、g) 3抗血清(抗體，Ab),1 標準抗原(Ag) 已知含量的非標記抗原 用途(1)免疫動物，制備抗體 (2)制備標記抗原 (3)作為標準品參與RIA反應(yīng)，繪制劑量反應(yīng)曲線 要求(1)質(zhì)量上高純度 與被測抗原屬同一物質(zhì)，具有 相同的免疫(生物)活性，

18、高度純化 (2)數(shù)量上高準確度 分一級標準(國家或國際標準) 二級標準(廠家或?qū)嶒炇覙藴? (3)穩(wěn)定性好，便于貯存、運輸和使用,2 抗血清(抗體，Ab) 含有抗體的血清 質(zhì)量指標 (1)親和力 (2)交叉反應(yīng)率

19、 (3)滴度,(1)親和力 Ab與Ag的結(jié)合能力，用親和常數(shù)K表示 Scatchard作圖法得： B/F = K[Q0] – K[PQ] 為一直線 K = 直線斜率 K > 109L/mol,(2)交叉反應(yīng)率 Ab與Ag類似物的結(jié)合程度，表示Ab的特異性。分別用Ag和Ag類似物（Ag#）作劑量反應(yīng)曲線

20、 Ab與 *Ag結(jié)合 被抑制50% 時[Ag]量交叉反應(yīng)率= Ab與 *Ag結(jié)合 被抑制50% 時[Ag#]量,,(3)滴度 又稱效價，反映與一定量 Ag特異結(jié)合的Ab的濃度,用稀釋度表示

21、用一定量標記Ag與不同稀釋度的Ab反應(yīng)，作B%-Ab稀釋度曲線，B%=50%時對應(yīng)的Ab稀釋度即為Ab滴度, 合適的滴度為1:104-106,3 標記Ag 常用125I和3H標記化合物 要求： (1)適當(dāng)高的放射性比活度 影響方法的靈敏度和 精密度，標記Ag化學(xué)量≤被測Ag的最小量 (2)放射化學(xué)純度>95% 影響方法的靈敏度 (3)免疫活性與未標記Ag基本保持一致

22、 (4)穩(wěn)定性好，在一定條件下，穩(wěn)定期1-3月,標記Ag與Ab的用量對測定的影響 (1)待測Ag含量較高*Ag的比活度↓ Ab的滴度↓ 靈敏度↓ 曲線范圍↑ (2)待測Ag含量較低*Ag的比活度↑ Ab的滴度↑ 靈敏度↑ 曲線范圍↓,分離技術(shù)1 非特異性 (1)吸附法 分離劑：葡聚糖凝膠包被活性炭(DCC) F被吸附沉淀，重

23、復(fù)性差 (2)沉淀法 分離劑：聚乙二醇(PEG) B被沉淀，分離迅速， 非特異結(jié)合率高 (3)抽濾法 常用濾膜：玻璃纖維濾膜、微孔濾膜 B與F的分子量差別明顯時分離效果好,2 特異性分離方法 (1)雙抗體法 分離劑：第二抗體 (抗抗體， Ab2)

24、 分離時間長，非特異結(jié)合率低 (2)雙抗體+PEG法 分離迅速，非特異結(jié)合率低 (3)固相分離法 固相材料包被Ab1、Ab2 固相材料：纖維素(包被珠) 試管(包被管)

25、 磁化顆粒,分析方法1 反應(yīng)方式(1)平衡加樣法： 標準(待測)Ag + Ab + 標記 Ag →溫育→分離→ 測定(2)順序加樣法： 標準(待測)Ag +Ab→溫育→+標記Ag→溫育→分離→測定提高方法靈敏度的分析方法,2 反應(yīng)介質(zhì) Tris-HCl或PB緩沖液，pH7.4-7.8 離子強度0.05-0.1M

26、3 反應(yīng)溫度和時間 K大，37?C，1-3h；K小，4 ?C，過夜4 血樣的采集與保存 (1)大都采用原樣品(血清、血漿)，少數(shù)需經(jīng)提取 (2)不及時分析的樣品需分離出血清或血漿，-20 ?C存放 (3)采樣或反應(yīng)時常用抗凝劑：EDTA-Na2，防腐劑： NaN3，穩(wěn)定劑：0.5% BSA、0.1%明膠、抑肽酶等,RIA反應(yīng)管類型

27、 組 類型 基本反應(yīng)試劑 分離 別 名稱 常用符號 Ag Ab *Ag 試劑 總放射性管 T - - √

28、 - 標準 非特異結(jié)合管 N - - √ √ 曲線組 最大結(jié)合管 B0(S0) - √ √ √ 標準管 Si √ √ √

29、 √ 樣品組 樣品管 U √ √ √ √ 質(zhì)控組 質(zhì)控管 QC √ √ √ √,,,,數(shù)據(jù)處理 1 B% — D 曲線 2 B% — LogD 半對數(shù)反“S”曲線 3 B/

30、B0% — LogD 半對數(shù)反“S”曲線 4 Logit B/B0 — LogD 全對數(shù)直線 5四參數(shù)或五參數(shù)Logistic模型 曲線 6四參數(shù)單位點質(zhì)量作用模型 曲線,RIA的質(zhì)量控制 質(zhì)量控制的目的 對分析工作中產(chǎn)生的誤差進行檢查和質(zhì)量判斷，對出現(xiàn)的質(zhì)量異?，F(xiàn)象尋找原因并采取糾正措施，以保證分析誤差被控制在允許的范圍內(nèi)。杜絕過失誤差，校正系統(tǒng)誤差，控制隨機誤差。,質(zhì)量控制

31、的內(nèi)容(任務(wù))1實驗室內(nèi)部質(zhì)量控制 (1)批內(nèi)質(zhì)控 精密度評價 偏差分析 (2)批間質(zhì)控 精密度評價 偏差分析2實驗室外部質(zhì)

32、量控制(1)對某種分析方法的試劑 或試劑盒進行綜合評價 (2)對不同實驗室的分析工作 質(zhì)量進行比較,質(zhì)量控制樣品 質(zhì)控的“標準系統(tǒng)”－質(zhì)控血清(QC)要求：1 QC樣

33、品與待測樣品性質(zhì)相同 2 QC樣品與待測樣品中待測物相同，免疫活性一致 3 QC樣品中待測物量已知，分高、中、低三檔濃度 4足量制備，分裝，低溫存放，分批使用制備方法：1按三檔濃度收集多余病人血清，測定標示值 2在緩沖溶液中加入無待測物的蛋白質(zhì)，再溶入 三檔濃度待測物標準品，測定標示值使用方法

34、：QC樣品組數(shù)＝√待測樣品總數(shù) / 3 以組為單位在待測樣品中前、中、后放置測定,,質(zhì)量控制指標1靈敏度 能檢測出與B0管具統(tǒng)計差別的最小可測量 (1)B0%-2SD的相應(yīng)劑量 (2)B0%-10%的相應(yīng)劑量 (3)由精密度圖得出2特異性 抗體識別其抗原的能力，用交叉反應(yīng)率表示3精密度 在相同條件下，對某一樣品多次檢測

35、所得結(jié)果的 符合程度，評價隨機誤差 ∑( Xi – X )2 |X1 – X2| SD = ——————— n=2時，SD = ————— n – 1

36、 √2,,,,,,,,4偏差 測定值偏離真值的程度，評價系統(tǒng)誤差 準確度 測定值與真值的符合程度，評價系統(tǒng)誤差和隨機誤差 測定值 - 真值 偏差b = ——————— X 100% 真值 準確度 =

37、√偏差2 + 精密度2 = √b2 + SD25穩(wěn)定性 批間的重復(fù)性 B0%、NSB%、ED25、ED50、ED75、QC樣品測定值6臨床有效性 一項分析方法完成臨床目的的程度 正常值及其范圍、正常值與異常值交叉范圍、 診斷符合率(陽性率、陰性率、假陽性率、假陰性率),,,實驗室內(nèi)部質(zhì)量控制方法1對實驗數(shù)據(jù)進行審核剔除“壞點”2

38、劑量反應(yīng)曲線擬合及質(zhì)量審核3精密度評價 (1)反應(yīng)誤差關(guān)系RER 從多批實驗資料求出直線方程式 SDR = a + bR a反映分離誤差 b反映加樣誤差(2)精密度圖(P-P圖) (用劑量反應(yīng)曲線) 通過RER將SDR轉(zhuǎn)換SDD(CVD%) 作SDD (CVD%) - lgD曲線CVD%≤10%,4偏差與準確度評價 (1)回收實驗 反映偏差

39、 測定值-空白值 回收率% = ————— X 100% 已知值 回收率% = 100% ± 10% (2)健全性試驗 用標準品和樣品分別作劑量反應(yīng)曲線和樣品稀釋曲線，兩條曲線應(yīng)平行 (3)二樣本-Youden圖 反映準確度，用QC樣品 QC首-QC尾曲線，誤差≤±2SD,5穩(wěn)定性評價

40、 批間質(zhì)控，用QC樣品 (1)Cusum圖 每批QC測定值與靶值的差累計后按 批次連續(xù)作圖，折線兩端落差≤±5SD (2)質(zhì)控圖 QC測定值-批次曲線，誤差≤±3SD,評價 1 三種濃度2SD， 但3SD，雙向 隨機誤差大 3 三種濃度中一種>3SD， 兩種>2SD，

41、 三種>1SD，單向（＋或－） 系統(tǒng)誤差大,免疫放射分析(IRMA),基本原理1 IRMA反應(yīng)式 (1)單位點 Ag + *Ab ? Ag-*Ab + *Ab ? SP-Ag

42、 Ag-*Ab + SP-Ag-*Ab (2)雙位點 SP-Ab1 + Ag ? SP-Ab1-Ag ? *Ab2 SP-Ab1-Ag-*Ab2 + *Ab2

43、 SP：表示固相,2 IRMA數(shù)學(xué)函數(shù)式 k1 Ag + *Ab ? Ag-*Ab

44、k2 P + Q PQ P = [Ag] P0 = [Ag0] Q = [*Ab] Q0 = [*Ab0] PQ = [Ag - *Ab] =

45、 B k1 [PQ] [PQ] K = — = ——— = —————————— k2 [P] [Q] ([P0] - [PQ]) ([Q0] - [PQ]) B

46、 = ———————— 展開重排 ([P0]-B) ([Q0]-B) B2 – B ([P0] + [Q0] + 1/K ) + [P0] [Q0] = 0,3 劑量反應(yīng)曲線,方法分類1 雙抗體夾心法 （1） SP-Ab1 + Ag ? SP-Ab1-Ag

47、 ? *Ab2 SP-Ab1-Ag-*Ab2 + *Ab2 （2） Ag + *Ab2 ? Ag-*Ab2 + *Ab2 ? SP-Ab1 SP-Ab1-Ag-*Ab2 + *Ab2 （3） S

48、P-Ab1+Ag+*Ab2 ? SP-Ab1-Ag-*Ab2+*Ab2,2 標記第三抗體 SP-Ab1 + Ag + Ab2 ? SP-Ab1-Ag-Ab2 *Ab3 ? SP-Ab1-Ag-Ab2-*Ab3 *Ab3：第三抗體（抗抗體），為兔（豚鼠） 抗小鼠IgG抗血清

49、 優(yōu)點：通用性標記抗體,3 雙標記抗體法 *Ab2 *Ab2SP-Ab1 + Ag ? SP-Ab1-Ag ? SP-Ab1-Ag

50、 *Ab3 *Ab3 優(yōu)點：放射性比活度提高，就提高了方法的靈敏 度和精密度,,,影響免疫放射分析的主要因素1被測抗原的性質(zhì) 雙位點IRMA要求被測抗原有兩個以上的 結(jié)合位點，方

51、法局限于多肽和蛋白質(zhì)抗原的分析2結(jié)合在固相抗體上的抗原穩(wěn)定性 被結(jié)合的抗原數(shù)量較多 時，抗原從固相抗體上分離的傾向更明顯 高濃度的準確度較低濃度差3反應(yīng)時間和溫度 室溫或4?C，24h；37?C，1.5-3h4標記抗體的濃度 標記抗體↑，測定范圍↑，NSB↑5固相物的洗滌 洗滌↓，CPM↑，洗滌↑，CPM

52、↓6血清等的非特異性效應(yīng) 溫度↑，血清效應(yīng)↑,IRMA反應(yīng)管類型 組 類型 基本反應(yīng)試劑 分離 別 名稱 常用符號 Ag *Ab 試劑

53、 總放射性管 T - √ - 標準 非特異結(jié)合管 N(S0) - √ √ 曲線組 最大結(jié)合管 Bmax(Smax) √ √ √

54、 標準管 Si √ √ √ 樣品組 樣品管 U √ √ √ 質(zhì)控組 質(zhì)控管 QC

55、 √ √ √,,,,數(shù)據(jù)處理1 B% - D 曲線2 B% -LogD 半對數(shù)“S”曲線3 B/BMAX% - LogD 半對數(shù)“S”曲線4 CPM - LogD 半對數(shù)“S”曲線，一定范圍為直線5 五參數(shù)Logistic模型 曲線6 三參數(shù)單位點質(zhì)量作用模型 曲線,標準曲線,免疫放射分析的特點1示蹤劑 標記抗體，即蛋白125I標記，標記容易，放射性比活度高

56、2反應(yīng)動力學(xué) 標記抗體是過量的，所以反應(yīng)速度比RIA快3靈敏度 靈敏度比RIA高1－2個數(shù)量級（10－100倍） 4特異性 固相抗體和標記抗體為McAb，特異性更高5標準曲線的工作范圍 K相同時，標記抗體↑，測定范圍↑，NSB↑ 抗體相同時，K↑，斜率↑，測定范圍↓，曲線對稱性↓ K和抗體選擇得當(dāng)，工作范圍(3個數(shù)量級)比RIA(2個數(shù)量級)寬6倍以上6方法的穩(wěn)健性 方法穩(wěn)定，批內(nèi)、批間

57、誤差小 K對劑量反應(yīng)曲線的影響：當(dāng)[?Ab]>1/K，影響小 [Ab]過量，K受溫度（4?C－37?C）的影響小 加樣誤差小，?Ab過量，只有加Ag時要注意,RIA與IRMA原理比較 RIA IRMA 競爭性 非競爭性

58、 *Ag *Ab *Ag、Ag、Ab Ag、*Ab Ab限量 Ab過量 B-D呈負相關(guān) B-D呈正相關(guān) 反應(yīng)達平衡慢 反應(yīng)達平