受體分析檢查檢驗(yàn)核醫(yī)學(xué)

1、1,受體（receptor）是細(xì)胞膜上或細(xì)胞內(nèi)的一些能與生物活性物質(zhì)相互作用并引起特異性生物效應(yīng)的物質(zhì)。受體與其配體（ligand）結(jié)合后，通過受體特定的信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)，引起細(xì)胞的特定反應(yīng)，是高等動(dòng)物適應(yīng)環(huán)境、協(xié)調(diào)機(jī)體各種細(xì)胞功能的關(guān)鍵性分子。,2,受體的放射性配體結(jié)合分析（radioligand binding assay of receptors，RBA）是用放射性核素標(biāo)記的配體與相應(yīng)的受體進(jìn)行特異性結(jié)合反應(yīng)，從而對受體進(jìn)行定性或定

2、量分析。,放射性配體,+,受體分子,受體配體 復(fù)合物,,分離B與F,,,測定，計(jì)算受體數(shù)量及親和力,3,定量RBA是在已知配體與受體反應(yīng)的基礎(chǔ)上，通過結(jié)合反應(yīng)得知一定數(shù)量的組織或細(xì)胞與該放射性配體結(jié)合的受體數(shù)量，即結(jié)合位點(diǎn)數(shù)。配體與受體的親和力以結(jié)合反應(yīng)的平衡解離常數(shù)表示。定性RBA則通過反應(yīng)量效關(guān)系、某些參數(shù)的變化等判斷受體的類型、結(jié)合方式（單位點(diǎn)系統(tǒng)或多位點(diǎn)系統(tǒng)）、受體與配體相互作用特點(diǎn)等。,4,一、RBA的主

3、要優(yōu)點(diǎn),1、高靈敏度2、特異性強(qiáng)、專一性好3、受體制劑的多用性,5,二、受體的分類,膜受體核受體,6,（一）膜受體,由胞膜外、胞膜內(nèi)、跨膜區(qū)組成。按跨膜區(qū)又可分為：1、G蛋白偶聯(lián)受體（神經(jīng)遞質(zhì)、前列腺素等）2、單一跨膜區(qū)有激酶活性受體（細(xì)胞因子）3、單一跨膜區(qū)無激酶活性受體（生長因子、INS）4、離子通道型受體（Na+、K+、Cl-、Ca++等）,7,8,2、核受體 受體在細(xì)胞核上，通過與細(xì)胞核內(nèi)特定的DNA結(jié)合后影響

4、遺傳信息的轉(zhuǎn)錄。核受體一般是由400～1,000個(gè)氨基酸殘基組成的可溶性單體蛋白質(zhì)。氨基端是高度可變區(qū)，與轉(zhuǎn)錄的特異性有關(guān)。中間是DNA結(jié)合區(qū)，富含半胱氨酸，含有兩個(gè)“鋅指”結(jié)構(gòu)，受體通過“鋅指”與DNA結(jié)合；該區(qū)域部位保守性強(qiáng)。羧基端為激素結(jié)合區(qū)。 糖皮質(zhì)激素受體類、性激素受體類、甲狀腺激素受體類。,9,三、受體與其配基作用的特點(diǎn),1．可飽和性2．可逆性3、特異性和親和力4．生物效應(yīng)的一致性 5. 需具有內(nèi)源性配體,10,1

5、．可飽和性每個(gè)細(xì)胞所含的受體數(shù)目有限，故配體與受體的結(jié)合反應(yīng)具有可飽和性，呈高親和力和低容量。2、可逆性配體與受體的結(jié)合是可逆的，當(dāng)受體周圍配體濃度降低，結(jié)合反應(yīng)就逆向進(jìn)行，即配體與受體解離，解離后的配體是原形，不起代謝變化。,11,3、特異性和親和力受體有特異識(shí)別配體的作用，只有嚴(yán)格構(gòu)型和構(gòu)象的配體才能選擇性地與某受體結(jié)合。受體的特異性還表現(xiàn)在器官或組織的專一性。受體的親和力表明其與配體的結(jié)合能力，高親和力說明受體配體結(jié)合牢固

6、。平衡解離常數(shù)在10-9mol/L以上的被認(rèn)為高親和力受體。,12,4．生物效應(yīng)的一致性受體的主要功能是介導(dǎo)配體的生物效應(yīng)，如一種蛋白質(zhì)與某種物質(zhì)結(jié)合而不介導(dǎo)特定生物效應(yīng)，則此蛋白質(zhì)不能稱之為受體。5. 需具有內(nèi)源性配體受體都需有內(nèi)源性配體，如果通過外源性配體發(fā)現(xiàn)某種蛋白質(zhì)分子具有類似受體的特性，但未找到內(nèi)源性配體，則稱之為孤兒受體，不能認(rèn)為是真正的受體。,13,四、單位點(diǎn)系統(tǒng)RBA的基本原理,1、簡單單位點(diǎn)系統(tǒng)受體配體相互作用的

7、基本規(guī)律 不少受體與配體結(jié)合的系統(tǒng)只存在一種結(jié)合位點(diǎn)，即簡單單位點(diǎn)系統(tǒng)，其基本規(guī)律符合質(zhì)量作用定律。質(zhì)量作用定律,14,?1=?1[R][L]， ?2=?2[RL]平衡時(shí)：?1[R][L]= ?2[RL]則平衡解離常數(shù)： KD=?2/?1=[R].[L]/[RL] KD是平衡解離常數(shù),為平衡親和常數(shù)KA的倒數(shù)，單位為mol/L，

8、KD越大表示親和力越低。,15,設(shè)受體和配體的初始濃度為[RT]和[LT],[R]=[RT-RL]，[L]=[LT-RL]，則：經(jīng)整理后得： [RL]2 — [RL][RT + LT + KD] + [RT][LT]= 0 對特定配體和某一固定量的特定受體，[RT]和KD均是定值，于是[RL]僅隨[LT]而變，二者呈雙曲線函數(shù)關(guān)系。,16,2、飽和曲線簡單單位點(diǎn)系統(tǒng)RBA應(yīng)能得到典型的飽和曲線。以[RL]為縱坐標(biāo)，

9、[LT]為橫坐標(biāo)，得到[RL]隨[LT]變化的曲線。配體的濃度從零開始上升時(shí)，復(fù)合物濃度先是上升很快，以后逐漸變慢，最后絕大部分受體都與配體結(jié)合，即受體飽和了。此就是飽和曲線。飽和曲線趨向水平則說明大部分受體已與配體結(jié)合。,17,18,（1）總結(jié)合（total binding，TB）,受體與標(biāo)記配體結(jié)合時(shí)，測量得到的放射性還含有一部分（反應(yīng)管壁吸附、雜蛋白吸附、分離不完全等）未與受體結(jié)合的標(biāo)記配體的放射性，需將此部分減去才能得到特異結(jié)

10、合計(jì)數(shù)。,19,（2）非特異結(jié)合（non-specific binding，NSB）,放射性配體除與受體特異性結(jié)合外，尚可與其他成分結(jié)合，稱之為NSB。主要來自雜蛋白、反應(yīng)器壁、分離材料的吸附等。特點(diǎn)是結(jié)合容量大而親和力小，不會(huì)出現(xiàn)飽和現(xiàn)象，結(jié)合量與所使用的配體量呈線性關(guān)系。常做一系列平行管，條件與TB相同，多加200 ∽ 1000倍非標(biāo)記配體以取代標(biāo)記配體與受體結(jié)合，測得的即NSB。,20,（3）特異結(jié)合（specific b

11、inding，SB）,受體與標(biāo)記配體結(jié)合的放射性計(jì)數(shù)，無法直接獲得。常用相同濃度的TB減去NSB求得。,21,TB,SB,NSB,22,五、離體RBA的基本方法,制備待測受體的離體標(biāo)本,加放射性配體溫育一定時(shí)間,終止反應(yīng)、分離結(jié)合與游離部分,測定結(jié)合部分的放射性,數(shù)據(jù)處理、求出有關(guān)參數(shù),,,,,23,（一）基本試劑及制備,1、受體樣本2、放射標(biāo)記配基3、非標(biāo)記配基,24,1、待測受體標(biāo)本的制備,用于離體RBA的標(biāo)本大體可分為組織切片

12、、完整細(xì)胞懸液、經(jīng)初步分離的細(xì)胞組分及經(jīng)增溶或進(jìn)一步純化的受體蛋白等。,25,1）組織切片為保持受體活性，常用冷凍組織切片，厚度5～50 ?m，將其貼于涂有明膠的玻片上，在溫育緩沖液中與標(biāo)記配體進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)后洗去游離部分。可刮下切片測量其放射性活度，也可用放射自顯影或免疫組化研究受體分布。,26,2）完整細(xì)胞懸液的制備血細(xì)胞可用通常分離血中有形成分的方法分離。 從組織中分離細(xì)胞一般是用膠原酶處理組織，再將游離的細(xì)胞分離出來。用完

13、整細(xì)胞進(jìn)行RBA的主要優(yōu)點(diǎn)是可同時(shí)觀察配體與受體結(jié)合的情況和細(xì)胞的生物效應(yīng)，得到的結(jié)果更能反映受體的生理特性。此外，還可直接給出平均每個(gè)細(xì)胞的受體數(shù)目。缺點(diǎn)是在處理過程中有時(shí)可能導(dǎo)致細(xì)胞表面生理活性的改變。有時(shí)受體在細(xì)胞中的含量很低，則需用較大量的細(xì)胞才能作一次實(shí)驗(yàn)。,27,3）細(xì)胞組分的分離組織勻漿多數(shù)RBA使用細(xì)胞組分進(jìn)行分析。其優(yōu)點(diǎn)是：①去除了大部分雜蛋白和內(nèi)源性配體，減少NSB或其他因素的干擾；②受體蛋白得到初步濃縮，受體制劑

14、的富集可獲得可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。,28,組織勻漿,沉淀：完整細(xì)胞、核受體,上清液,,,,,800～3500×g, 10～15 min,沉淀：線粒體，膜受體,上清液,,,,10,000～300,000×g, 10～15 min,沉淀：微粒體,上清液：漿受體,10,000～300,000×g, 10～15 min,,,,,29,2、放射標(biāo)記配基,1）高親和力、高特異性2）高穩(wěn)定性3）高比活度4）高放化純,30

15、,3、非標(biāo)記配基,用來設(shè)立NSB，可以與標(biāo)記配基同一物質(zhì)，也可不同，但必須與受體結(jié)合有高親和力。,31,（二）溫育條件,1、緩沖液 2、時(shí)間與溫度,32,（三）分離,分離的目的是將已形成的放射性復(fù)合物與游離的放射性配體分開，測定其復(fù)合物放射性。一旦分離，原有的反應(yīng)平衡被破壞，因此在分離過程中要使復(fù)合物的解離降低到最低程度，低溫和快速是最有效的措施。常用的分離方法有：1、平衡透析法；2、離心法3、過濾法,33,六、定量RBA的

16、數(shù)據(jù)處理,定量RBA主要是通過測得的樣品的數(shù)據(jù)及所用標(biāo)記配體的量和比活度，通過數(shù)學(xué)模型進(jìn)行運(yùn)算，得出受體的有關(guān)參數(shù)[RT]、KD等。,34,1、單點(diǎn)法,僅取一個(gè)濃度點(diǎn)的標(biāo)記配體，標(biāo)記配體的量可使受體飽和并略有剩余（過量）。該法操作簡便，標(biāo)本用量少，但只能給出受體的最大結(jié)合位點(diǎn)數(shù)（RT），無法得了該配體與受體的親和力（KD）。,35,單點(diǎn)法RBA的數(shù)據(jù)處理,(1)從實(shí)驗(yàn)所得到的總結(jié)合TB減去非特異性結(jié)合NSB的平均放射性計(jì)數(shù)（cpm）得

17、到特異性結(jié)合RL的cpm。(2)根據(jù)儀器測量效率將RL的cpm換算成dpm, 用配體的比活度再換算成mol。(3)受體與配體的結(jié)合按1：1形成復(fù)合物，則RL的mol即為受體結(jié)合位點(diǎn)的mol數(shù)。,36,(4)另取一定量的樣品測蛋白含量或細(xì)胞數(shù)，即可算成一定量蛋白或一定細(xì)胞數(shù)中RT的mol數(shù),即為[RT]。(5)還可進(jìn)一步將mol換算成分子數(shù)（1 mol=6.02×1023個(gè)分子），從而得到單位細(xì)胞或單位蛋白的受體結(jié)合位點(diǎn)數(shù)

18、。,37,此式中受體與配體為1：1關(guān)系，如受體與配體以1：2關(guān)系形成復(fù)合物，則上式應(yīng)被2除。對于完整細(xì)胞，則按細(xì)胞數(shù)進(jìn)行計(jì)算，以mol/106細(xì)胞或受體位點(diǎn)數(shù)/106細(xì)胞表示。,38,例,實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行外周血WBC的GCR分析，測得TB為4500cpm，NSB為2500cpm，3H-Dex的SA為1.85×1012Bq/mmol，蛋白量為1mg，液閃的Eff=30%SB=TB-NSB=4500-2500=2000cpm20

19、00/（0.3×60×1.85×1012×1）=60fmol/mg,39,1mol=6.02×1023分子60fmol/mg= 60×10-15×6.02×1023=3.6×1010受體/mg蛋白若：WBC細(xì)胞數(shù)為7.5×106個(gè)，則[RT]=3.6×1010/ 7.5×106=4800受體/細(xì)胞

20、,40,2、多點(diǎn)法,多點(diǎn)法實(shí)驗(yàn)可分簡單單位點(diǎn)和雙（多）位點(diǎn)兩部分。常用多點(diǎn)飽和曲線法：即每一受體標(biāo)本做6∽8個(gè)標(biāo)記配體濃度點(diǎn)（多位點(diǎn)所需濃度點(diǎn)更多），標(biāo)記配體的用量應(yīng)覆蓋受體的飽和區(qū)和不飽和曲，以得到飽和曲線。數(shù)據(jù)處理是將數(shù)學(xué)模型直線化，再將測得數(shù)據(jù)進(jìn)行直線擬合，求出所需參數(shù)。計(jì)算機(jī)普及后，人們用計(jì)算機(jī)進(jìn)行曲線擬合，以減少直線化帶來的誤差。,41,Scatchard作圖簡單單位點(diǎn)系統(tǒng)在Scatchard作圖中應(yīng)呈一條直線。以[

21、RL]/[L]對[RL]作圖，即為Scatchard作圖。在簡單單位點(diǎn)系統(tǒng)，應(yīng)得一直線。斜率是 -1/KD，而直線與橫軸的交點(diǎn)則等于[RT]值。,42,43,例： 實(shí)驗(yàn)室做外周血WBC的GCR多點(diǎn)分析，3H-Dex的SA為38.0Ci/mmol，放化純?yōu)?9%，配成工作濃度10uCi/ml.,44,1、加樣程序,45,2、測量結(jié)果,46,3、建立NSB的回歸方程,以NSB管的cpm對3H-Dex的體積數(shù)（10、20、25、、30

22、40、50）建立回歸方程，得到： Y=52.5456X+45.7007（r=0.9997） 將未做的NSB管對應(yīng)的3H-Dex體積（20、40）代入方程，得到NSB各管值。 （10、571）；（20、1097）；（25、1359）；（30、1622）；（40、2148）；（50、2673）,47,4、計(jì)算B、F和B/F,48,5、換算B相對應(yīng)的3H-Dex 物質(zhì)量,比放= SA為38.0Ci/mmol，放化純?yōu)?9%，

23、Eff=42%1、38Ci/mmol=38uCi/nmol=1.406×106Bq/nmol2、1nmol=1.406×106Bq÷0.99=1.4202×106Bq3、1cpm=1/(0.42×60)=0.03968Bq =0.03968/(1. 4202×106Bq)=0.0282fmol,49,換算B對應(yīng)的fmol數(shù),1215cpm--

24、----34.26（fmol）1702cpm------48.00 （fmol）1963cpm------55.36 （fmol）2005cpm------56.54（fmol）2087cpm------58.85 （fmol）2067cpm------58.30 （fmol）以B對應(yīng)的fmol數(shù)為橫坐標(biāo)，B/F為縱坐標(biāo)進(jìn)行Scatchard作圖,50,6、Scatchard作圖,51,7、計(jì)算[RT]和KD,y=0時(shí)，對應(yīng)

25、的為[RT] 即 [RT]=0.01542/0.0001972=78.195fmol 如果細(xì)胞數(shù)為7.5×106個(gè)，則 [RT]=6276個(gè)受體/細(xì)胞截距=[RT]/KD，故KD=[RT]/截距 截距為X=0時(shí)的y值，故： KD=[RT]/0.01542=5.07nM,52,六、RBA的應(yīng)用價(jià)值,1、受體與疾病 　2、受體與腫瘤 　3、受體在藥物研究中的應(yīng)用價(jià)值　　1）在藥物作用