第六章--放射免疫實驗

1、第三章 放射免疫分析技術,體外放射分析技術,利用放射分析方法或其派生的相關技術在體外進行體內物質種類和含量的分析測定。,競爭性放射分析——放射免疫分析（RIA）非競爭性放射分析——免疫放射分析（IRMA）,,,,待測物質濃度與檢測手段,臨床化學分析,,,,,,,pg/mL,ng/mL,mg/mL,mg/mL,g/L,免疫分析,Therapeutic Drugs,Thyroid Hormone,Fertility Hormone,Al

2、lergy,Cancer Markers,Infectious Disease,Vitamins,Serum Proteins,,,,,,,,,第三章 放射免疫分析,放射免疫分析法免疫放射分析法臨床應用,放射免疫分析的創(chuàng)立,1959 美國Yalow & Berson1960 英國 Ekim’s1977 獲諾貝爾醫(yī)學生物學獎,醫(yī)學生物學超微量分析的里程碑,1959年，Y

3、alow和Berson創(chuàng)立了放射免疫分析法（RIA），并因此于1977年獲得諾貝爾生物醫(yī)學獎。這種方法結合了放射性核素測量的高靈敏性和免疫抗原-抗體反應的高特異性兩大特點，開創(chuàng)了生物活性物質微量測定技術的先河。,女科學家 R.Yalow,放射免疫分析法（Radioimmunoassay，RIA）,基本原理,Ag + Ab Ag-Ab + Ag*

4、 Ag*-Ab,競爭結合：放射性標記的抗原（Ag*）和非標記的抗原（Ag）在同一反應系統(tǒng)中與特異性抗體（Ab）的競爭性結合。,,,,,,,在上反應式中：Ag與Ag*的免疫活性相同，即與Ab有相同的親和力；Ab的結合位點數(shù)＞Ag或Ag*，但＜Ag+Ag*；Ag*與Ab的量是恒定的，Ag是待測量。,二種抗原(Ag 、Ag*)與Ab結合的量取決于兩者的濃度比例，Ag量多，則AgAb結合多，Ag*Ab結合量就少，即Ag*Ab將隨Ag的

5、增加而減少，呈負相關，表現(xiàn)為函數(shù)關系。在系統(tǒng)中，Ag*Ab的量可通過測定放射性而獲得，再根據(jù)函數(shù)關系求Ag的量。,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,+,,,,,,,,,,,,,,+,,,,,,,,,,,,,,+,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,+,,,,,,,,,,,,,,+,,,+,,,,,+,,,,,,,+,,,,,,,,Bound,Free,A

6、g,Ab,標準曲線,標準曲線又稱為劑量反應曲線，以一系列遞增濃度的Ag及一定量的Ag*與恒定量限量的Ab競爭結合反應而得，是對待測物進行定量分析的基礎。,標準曲線實例,,標準曲線:,① 配制一系列已知濃度的標準抗原，分別向其中加入固定量的標記抗原和抗體，反應平衡后，分離抗原的結合部分和游離部分，測定*Ag-Ab的放射性B。②B0為標準抗原濃度=0時的放射性值。,放免分析基本條件,（一）標準抗原（二）特異性抗體（三）標記抗原（四）

7、分離技術,a. 概念：是指已知真實含量，且不含對免疫反應產生干擾雜志的抗原。b. 用途： 免疫動物制備抗體——Ab 放射性核素標記——Ag* 繪制劑量反應曲線c. 要求： 高純度 高準確度 良好的穩(wěn)定性,（一）標準抗原,（二）特異性抗體,a. 對特異性結合抗體的要求：1．親和力 （affinity）高：指單個抗體分子與抗原決定簇特異結合

8、的能力，用 親和常數(shù)Ka 值表示，反映靈敏度，Ka應達109~1012mol/L。2．特異性高：與待測抗原的結合力高，而與待測抗原類似物的結合能力（交叉反應率）低。3．滴度 （效價）高：指將血清稀釋時能與抗原發(fā)生反應的最高稀釋度。它反映抗血清中有效抗體的濃度。稀釋倍數(shù)越高，滴度(titer)越高，表示抗體的效價越高。4．穩(wěn)定性好：能長期保存，化學性質、效價穩(wěn)定。,b. 抗血清的制備：1.大分子物質可直接免疫動物誘導抗體產生，但是

9、小分子物質為半抗原，必須與載體結合制成人工抗原（半抗原-蛋白質），才能進行免疫。2．選擇合適的免疫動物：兔、鼠、羊。3．應用佐劑：福氏完全佐劑與不完全佐劑（羊毛脂、石蠟油 +卡介苗）。4．選擇合適的免疫方法：劑量、接種途徑（腹股溝、腋窩、脊柱兩側皮內多點）、間隔時間（加強）與次數(shù)。,c.單克隆抗體的使用：,特異性高 親和力低，不一定優(yōu)于傳統(tǒng)的多克隆抗體,對標記抗原的要求：1．放射性比活度高：即單位物質的放射性強度高，一

10、般至少達到370GBq/mmol。2．免疫活性：與標記前一致。3．放射化學純度高：應 > 95%。4．穩(wěn)定性好：標記的同位素不易脫落。,（三）標記抗原,常用標記核素：（1）125I： γ 射線，半衰期 60 天（2）3H： β 射線，半衰期 12.3 年測量儀器：（1）γ 計數(shù)儀（2）β液體閃爍計數(shù)器,兩種標記方法的優(yōu)缺點,3H標記物 125I 標記物 貨架期

11、長 貨架期短以3H置換H，對原物質 以125I取代H，可能影響 免疫活性無改變 免疫活性 標記難度大，比活度低 標記方法簡單，比活度高 Β射線測量效率低 γ射線測量效率高 廢棄物處理較困難

12、 廢棄物處理較容易,a. 對分離方法的要求：1．使抗原-抗體復合物（B）與游離抗原（F）盡可能分離完全；2．分離后便于放射性測量；3．分離效果不受外界干擾因素的影響；4． 操作簡便、分離迅速、重復性好；5．與游離標記物的非特異性結合盡可能??；6. 試劑來源廣泛、價格低廉。,（四）分離技術,b. 常用的分離方法 1. 雙抗體法特點： 分離完全，非特異結合小，環(huán)境影響小，效價高，但分離時間長，成本高

13、。,2. 沉淀法 聚乙二醇（w=6000）特點： 快速，價廉，來源方便，受環(huán)境影響大3. 雙抗體PEG法將雙抗體和沉淀法兩者結合進行分離。本法具有兩種方法的優(yōu)點，并克服了雙抗體分離時間長和沉淀法非特異性結合高的缺點。,4．固相分離法將抗體通過特殊技術聯(lián)結在固相載體上，免疫反應在固相載體上完成，達到平衡后形成固相的Ag-Ab 復合物，可與游離部分分離。此方法具有操作簡便，迅速，分離效果好，非特異性結合低等優(yōu)

14、點。,,,5.磁化分離法6.葡萄球菌A蛋白分離法（SPA分離法） 7. 微孔濾膜法,放免分析的優(yōu)點,靈敏度高特異性強精確度高用血量少缺點：污染；放射性核素衰變及不穩(wěn)定,第三章 放射免疫分析,放射免疫分析法免疫放射分析法臨床應用,1968年，Miles和Hales創(chuàng)立了免疫放射分析法（IRMA）。IRMA與IRA不同，它是將放射性核素標記在抗體上，而不是標記在抗原上。同時所用的標記抗體與待測抗原比較是過量的。

15、 Ag+Ab* Ag-Ab*+Ab* B F由上式可見， IRMA不存在競爭反應，是待測抗原直接與標記抗體反應。待測抗原的量與抗原-標記抗體復合物的量成正相關關系。,免疫放射分析法（immunoradiometric assay，IRMA）,,,1.單位點IRMA,單位點（one-site）IRMA是利用過量的標記抗體（Ab*）與待測抗原（Ag）進行免疫結合反應，

16、形成抗原標記抗體復合物，當反應達到平衡后，再用固相抗原免疫吸附劑（SP-Ag）與剩余的標記抗體結合，并將其分離。,2.雙位點IRMA,將抗體1結合于固相表面，加入標本后，待測抗原與固相抗體形成抗原-抗體復合物，并留在固相表面。洗去其他物質后，加入標記抗體2，在固相表面形成抗體-抗原-標記抗體復合物，再洗去多余標記抗體，即可達到分離目的。,競爭性分析與非競爭分析的比較,第三章 放射免疫分析,放射免疫分析法免疫放射分析法臨床應用,放射免

17、疫分析技術的臨床應用,一 甲狀腺疾病二 代謝類疾病三 骨和礦物質代謝四 腫瘤五 心血管疾病六 器官移植中的藥物監(jiān)控,一 甲狀腺疾病,TSH 促甲狀腺激素STSH 高靈敏度甲狀腺激素FT3 血清游離三碘甲狀腺原氨酸 FT4 游離甲狀腺素 TgAb 抗甲狀腺球蛋白抗體TmAb抗甲狀腺微粒體抗體,臨床上確診為甲狀腺功能亢進的步驟,臨床上確診為甲狀腺功能減退的步驟,二 代謝類疾病,胰島素原（proinsulin）正常生理條

18、件下，胰島素原分子釋放很少，占總分泌5%-10%，因此不考慮其對胰島素測定的影響。在病理情況下，如胰島素瘤，血中胰島素原可達50%-70%。目前，市場上已有用純胰島素原做為標準品的放免藥盒，可用來直接測定血清或血漿中的胰島素原含量。,人真胰島素(insulin specific)不經(jīng)處理的血漿，通過放免法測得的胰島素稱為免疫反應性胰島素（IRI），IRI與胰島素原有明顯的交叉反應，當血清中胰島素原含量較高時，應考慮對胰島素測定的影響。

19、人真胰島素放免分析可特異性測定人血清中與胰島素原無交叉反應的胰島素水平，是確切評價β細胞功能和胰島素敏感性的關鍵指標。,三 骨和礦物質代謝,1,25二羥基維生素D及25羥基維生素D體內維生素D經(jīng)日光紫外線照射、且在C1和C25位羥基化后，才能轉變?yōu)橛谢钚缘木S生素D代謝物。測定血清中1,25二羥基維生素D及25羥基維生素D的濃度可鑒別與維生素代謝有關的疾病。目前國內用維生素D放免藥盒用于維生素D缺乏癥、骨營養(yǎng)不良、肝炎和藥物性維生素

20、D紊亂、甲狀旁腺功能亢進或減退的測定。,降鈣素（CT）和甲狀旁腺激素（PTH）CT及PTH參與鈣穩(wěn)態(tài)調節(jié)機制：當血鈣降低時，PTH分泌增加，作用于骨促進溶骨，鈣自骨釋出，同時作用于腎使腎小管對鈣回吸增多。血鈣上升則刺激甲狀腺分泌CT抑制骨鈣釋放，同時促進腎小球對鈣的排出。CT和PTH的分泌功能彼此成反饋關系，機體通過它們互相拮抗作用維持代謝的內環(huán)境穩(wěn)定。降鈣素和甲狀旁腺激素對鈣代謝的調節(jié)不僅取決于它們在血中含量的絕對值，更重要是它們

21、的比值。因此測定它們的比值對內分泌代謝病研究很有價值。,骨鈣素（OC）骨鈣素由成骨細胞合成，在合成過程中不斷有少量骨鈣素釋放到循環(huán)系統(tǒng)中，骨鈣素的水平直接反映骨骼生成狀況，其檢測可以幫助評價骨骼更新程度，高水平的骨鈣素與骨代謝病相關。整分子骨鈣素放免藥盒（intact OC IRMA kit）可以用于軟骨病、Paget骨病、甲狀腺功能亢進、腎性營養(yǎng)不良、絕經(jīng)后骨質疏松癥的檢測。,四 腫瘤,甲胎蛋白（AFP）甲胎蛋白作為一種腫瘤特異

22、性抗原，對早期診斷原發(fā)性肝癌具有較高靈敏性和特異性。陽性率在60%~85%。癌胚抗原（CEA）癌胚抗原首先是從結腸癌和胚胎組織中提取的一種腫瘤相關抗原，癌胚抗原升高和消化道腫瘤密切相關。胃癌患者陽性率可高達50%以上。,糖類抗原（carbohydrate antigen，CA）CA50——胰腺癌、肝癌、結、直腸癌、卵巢癌、子宮癌、胃癌、肺癌、食道癌。CA19-9——對胰腺癌和膽囊癌診斷有較高特異性，陽性率＞80%，絕對值升高明顯

23、。CA125——非粘液性卵巢癌診斷特異性強。CYFRA21-1——肺癌的診斷和療效觀察。,五 心血管疾病,內皮素（ET） ET是一種內皮細胞來源的血管活性多肽，主要分布在血管內皮細胞，具有強大的縮血管和促血管平滑肌細胞增殖作用。與冠心病發(fā)生密切相關。急性心肌梗死和高血壓患者血中ET水平明顯增高。,肌紅蛋白（Mb）Mb廣泛分布于心肌和骨骼肌中，正常人血中含量低。當心肌和骨骼肌發(fā)生損傷時，血中Mb含量明顯升高?，F(xiàn)已將Mb測定廣泛用于

24、心肌梗死診斷、預后判斷及病情監(jiān)測。正常參考值RIA為6~85ng/ml，男性高于女性。心肌鈣蛋白T（TnT）TnT是心肌細胞收縮器結構蛋白的一種，正常人血清中幾乎測不到，而心肌梗死病人呈不同程度升高。 TnT檢測能敏感發(fā)現(xiàn)心肌細胞損害。對診斷有價值。,六 器官移植中的藥物檢測,環(huán)孢素（Cyclosporine ）環(huán)孢素是器官移植中最常用的免疫抑制劑。病人對藥物的吸收有個體差異。美國DiaSorin公司提供的環(huán)孢素放免藥盒，可以確定