瘧原蟲顯微鏡鏡檢技術

1、瘧原蟲顯微鏡鏡檢技術,東安縣疾病預防控制中心 周永玲2011.07.10,瘧疾簡介,瘧疾是一種古老的傳染病,俗稱“冷熱病”、“打擺子”、“發(fā)瘧子”、“脾寒”、“瘴氣”等，是由瘧原蟲寄生于人體引起的傳染性寄生蟲病。,寄生人體的四種瘧原蟲,間日瘧原蟲 [Plasmodium vivax，P.v]三日瘧原蟲[P．Malariae,P.m]惡性瘧原蟲 [P．Falciparum,P.f]卵形瘧原蟲[P．Ovale,P.o] 我國主要

2、是間日瘧常見，惡性瘧次之，三日瘧偶爾發(fā)現，卵形瘧已無病例報告。,鏡檢瘧原蟲方法簡述,19世紀后期，顯微鏡的出現使人們不斷發(fā)現了傳染病的病因。1880年法國軍醫(yī)拉韋朗第一次見到并描述了人紅細胞內的瘧原蟲，至此才解開了困擾人們數千年的瘧疾的病因之謎。,鏡檢瘧原蟲方法簡述,目前用于瘧疾診斷的實驗室檢測包括病原學檢查、免疫學檢測和分子生物學檢測三類。鏡檢瘧原蟲由于具有操作簡便、敏感、價廉和可鑒別蟲種等優(yōu)點，廣泛用于瘧疾的病原學診斷已愈近一個世紀

3、，仍是目前最常用的方法，也是我國瘧疾診斷標準確定的實驗室檢查方法（WS259-2006）。,鏡檢目的與意義,瘧疾診斷標準中把瘧疾病例分為疑似病例、臨床病例、確診病例和帶蟲者，前兩者依據流行病學史和臨床表現即可做出診斷，而后兩者需通過發(fā)現病原體方能做出診斷。通過對發(fā)熱病人血檢達到確診瘧疾病例。及時發(fā)現傳染源和明確感染的瘧原蟲種類，以能針對蟲種選擇正確的治療方案。,血片鏡檢,血片制作用于檢查瘧原蟲的血涂片有兩種：一種是將血液涂呈薄膜

4、狀，稱薄血膜。一種是血液涂成圓盤，稱厚血膜。薄血膜上的血細胞要求平輔在玻片上面。,血膜的制作（取血時間）,取血時機 現癥病人一般可隨時取血，瘧疾普查 時可不考慮取血時機。 在診斷或需要某期瘧原蟲作標本時，則應掌握適宜的取血時機。間日瘧在寒熱發(fā)作時，外周血液中主要可見環(huán)狀體期；發(fā)作后數小時，環(huán)狀體發(fā)育到滋養(yǎng)體期，瘧色素形成，形態(tài)較易辯認，為診斷的有利時機；36~48小時，可檢出裂殖體；發(fā)作一、二次后，配子體出現較多。惡性瘧較理想

5、的取血時間是在發(fā)作后至20小時內取血，初發(fā)患者退熱后常查不到原蟲。,血膜的制作（取血操作）,取血方法 采血部位一般人為耳垂，指頭，通常在耳垂取血（現場取血建議用大頭針采血，一人一針，避免血傳疾?。Ｏ扔?5%酒精棉球消毒取血部位（冬季用手捻動耳垂使其充血后再行消毒），待酒精干后，用左手拇指和食指緊捏耳垂上方，右手持消毒針迅速刺入耳垂下端1~2毫米，不宜過深或過淺。然后用右手中指輕輕向擠壓出血。,血膜的制作（取血操作）,取血量及涂片

6、法（涂片操作）,薄血膜 取潔凈的載玻片2張，1張平置在桌上，以左手拇指，食指夾持載玻片兩端（手指切勿接觸玻片表面），用另一張邊緣平滑（最好為磨口邊緣）的載玻片做推片，用推片一端邊緣的中點從取血部分取約1微升的血量（相當于1/4火柴頭大?。?，使血滴與平置的載玻片接觸，并形成25~30度夾角，待血液向兩側擴展約2厘米長度時，均勻而迅速地輕輕向左推出（約2.5厘米長），整個血膜成舌形。,正確的推片姿勢,取血量及涂片法（涂片操作）,厚血膜

7、 用推 片的一角，從取血部位刮取約4微升血量（相當于火柴頭?。寡闻c平置的載玻片接觸，再由里向外一個方向旋轉，轉2~4圈，涂成直徑0.8~1厘米大小圓形厚血膜，血膜厚薄均勻，過厚易于脫落，過薄達不到檢出率的要求。,涂制厚、薄血膜的位置 通常是將厚、薄血膜涂在一張載片上。方法是將載片分為6等分，第1、2格備貼標簽及編號用；厚血膜涂在第3格中央，薄血膜涂在第4格前緣至第6格中部。作為標本的血片每張玻片涂厚、薄血膜各1

8、個；門診和發(fā)熱病人血片每片1人，涂2個厚血膜1個薄血膜，以防血膜脫落而影響檢查。,標準的瘧疾厚薄血膜片位置,血片的染色,一、吉氏染液母液配制 取吉氏粉0.5克置于研缽中，加少量甘油充分研磨，邊加邊磨，至25毫升加完為止，倒入60或100毫升帶有玻塞的有色玻瓶中。在研缽中加少量無水甲醇，洗去甘油濃液混入瓶內，至25毫升甲醇洗凈缽中甘油染液為止，塞緊瓶塞，充分搖勻，置于55~60℃水浴中2小時，或室溫內3~5天，每天用力搖動5分鐘，即

9、成原液。吉氏染液是目前較優(yōu)良的血膜染劑，即使在炎熱天氣中，亦可經久不變。,血片的染色,二、瑞式染液的配制將瑞氏染劑粉1g置于研缽內，加入15ml甘油充分研磨后，倒入有塞玻璃瓶中，再用500ml甲醇洗出研缽中的甘油溶液，倒入瓶中，搖勻后，置室溫下，每天搖動5分鐘，3天后即可使用。此方法染色的時間短，但染色效果不如吉氏染液效果穩(wěn)定，又不能大量血片染色，可用于門診應急血片用。,血片的染色,吉氏染液血片染色方法 （推薦使用此方法）先用

10、甲醇或無水酒精固定薄血膜，待干后進行染色。在固定薄血膜后用清水對厚血膜溶脫血紅蛋白可用滴管滴水于厚血膜上，待血膜呈灰白色時，將水傾去，晾干后進行染色。 成批血片染色：將已固定薄血膜的血片插入染色缸，倒入2%吉氏染液稀釋液（2毫升原液加中性蒸餾水98毫升稀釋均勻即成），同時對厚薄血膜染色30分鐘（如染液不合標準時，得酌情增減染色時間），然后用清水輕輕將染液沖去，再用清水輕輕沖洗一次，干凈后將血片標本（血膜面朝下）插于晾干板上，待干鏡檢。

11、,血片的染色,單張血片染色：薄血膜經固定干燥后，用2%吉氏染液稀釋液1~2毫升，滴入血片標本上染色30分鐘左右；或用中性蒸餾水1毫升，加吉氏母液1~2滴，混合均勻后滴入血片標本上，染色10~20分鐘，然后用清水輕輕將片上的染液沖洗干凈，（切勿先倒掉染液再用水沖洗）晾干鏡檢。,瑞氏染液的染色方法：,先用蠟筆在厚、薄血膜間劃一界限，滴幾滴蒸餾水在厚血膜上溶血。溶血后傾去水滴。在薄血膜上加瑞氏染液5～8滴，染色1～2分鐘。然后再加5～8滴蒸餾

12、水于薄血膜上，用吸管將染液與蒸餾水混合均勻后，把染液引到厚血膜上，使厚血膜再染色10分鐘。用清水輕輕沖去染液，晾干。,血片的鏡檢,在學習鏡檢瘧原蟲之前，必須先對正常厚薄血膜中各種血細胞的形態(tài)、內部結構和染色性質加以識別。學習鏡檢瘧原蟲，首先要學看薄血膜，在基本上掌握薄血膜中瘧原蟲形態(tài)后，才學習鏡檢厚血膜。鏡檢瘧原蟲一般只查厚血膜，薄血膜僅作為原蟲分類時參考和血片編號之用。鏡檢瘧原蟲必須用油鏡頭配合5X低倍目鏡鏡檢，當發(fā)現疑難問題時

13、可調換10X目鏡進行觀察。檢查時應從厚血膜的上緣開始，使血膜從上而下，自左至右，由右至左，一行接一行，一個視野稍疊一個視野順序地查完整個血膜。,瘧原蟲血片檢查結果確定,檢查全部厚血膜未查見瘧原蟲者判為陰性。顯微鏡下查見瘧原蟲，根據瘧原蟲形態(tài)確定惡性瘧、間日瘧、三日瘧、卵形瘧或混合感染。,制作血膜的注意事項,1. 玻片清洗時，避免玻片碰撞、磨損。制作血膜的載玻片必須完全清潔而毫無油漬或污垢。制片時，手指只能持載片的邊緣，不能接觸玻片

14、表面，以免油污使薄血膜產生空白區(qū)以及厚血膜脫落。作為推片的玻片邊緣一定要平滑，才能使推出的血膜均勻一致。,制作血膜的注意事項,2. 剛涂制的血膜要平放在標本盒內，厚血膜未干前勿使標本盒傾斜，以免血膜傾向一側，造成血膜厚薄不均，厚處不溶血和著色而影響檢查結果；晾干血膜時應注意防塵、防止蒼蠅、蟑螂等昆蟲吮吸血膜，干后應及時裝入標本盒并蓋嚴，新的木制標本盒需敞開放置一段時間，讓木醇揮發(fā)后才能使用，以免厚血膜紅蛋白被其固定，不能溶血或染色效果不

15、佳。,制作血膜的注意事項,3. 血膜讓其自然干燥，切忌用太陽曬或火烤，干透后才能用甲醇固定薄血膜。夏天標本盡可能24~48小時內固定染色；冬天也不能超過72小時。放置時間越久，厚血膜越不易脫血，染色效果也差。若不能及時染色，薄血膜宜先用甲醇固定（1~3分鐘）然后用過濾清水對厚血膜溶血，晾干固定后裝入盒內蓋嚴，待以后染色。,影響染色效果的因素,血片染色好壞除了與玻片是否清潔，血片制作質量好壞等有關外，還受到以下幾個因素的影響：（1）染料

16、溶劑的質量 染料、甲醇和甘油如果不純，常使配制的染液偏酸或偏堿而影響染色效果。因此必須用分析純的甲醇和中性甘油，而且在配制時所用的器具必須干凈而無水份。,影響染色效果的因素,（2）染液的新舊 新配制的染液因色素尚未充分溶解，染色力較弱且常呈現偏堿性。染液存放時間越久，染色力越強。通常在染液配制1~2周后才使用，盛裝染液的瓶子應加塞蓋密。以防吸潮而影響染液質量。,影響染色效果的因素,（3）染液稀釋后使用時間 吉氏和瑞氏染液的主要成份

17、是美藍、伊紅和由美藍氧化產生的天青，三者能在酒精溶液中溶解，但在水溶液中伊紅遇到美藍和天青即產生沉淀。因此，必須在稀釋染液當時使用，一般在半小時內染色力最強。,影響染色效果的因素,（4）染液的稀釋濃度 染液的濃度高其著色就快而深，從而瘧原蟲寄生紅細胞的薛氏點粗大顯著，但顏色常偏堿；染液濃度過低則染色時間久，顏色偏酸，薛氏點不明顯或消失。（5）染色時間 染色時間長染色效果好，反之較差。室溫高則著色快，染色時間可略縮短，氣溫低可適當延

18、長。因此染色時間應根據染液的質量、新舊、稀釋濃度和氣溫而適當增減。,影響染色效果的因素,（6）染色用水 染液的稀釋用水和染色后沖洗用水應選擇Ph7.0~7.2清潔水，通常使用的新鮮的蒸餾水或過濾的冷開水，以及自來水、井水、河水、泉水和雨水等。如果偏酸或偏堿，可用緩沖蒸餾水調整。染色后發(fā)現血膜顏色偏藍（偏堿）或偏紅（偏酸）時，可用與之相反的酸、堿度水沖洗血片予以糾正。,影響染色效果的因素,（7）染色后不要直接將染液倒掉，應沿玻片或染色缸

19、邊緣加水使染液表面一層溢出，并輕輕沖洗，以免染液色素顆粒沾污血膜。,瘧原蟲形態(tài)特征和鑒別要點,在RBC內發(fā)現瘧原蟲是確診瘧疾和鑒別蟲種的重要依據瘧原蟲基本構造相同--細胞膜、質、核瑞氏或姬氏染色：核染成紫紅色，胞質呈蘭色，瘧原蟲消化血紅蛋白產物-瘧色素呈棕黃色瘧原蟲在RBC內各期形態(tài)各不相同,瘧原蟲在RBC內的形態(tài)（三期六種形態(tài)）,滋養(yǎng)體期：大、小滋養(yǎng)體裂殖體期：成熟、未成熟裂殖體配子體期：雌、雄配子體,人體瘧原蟲的基本結構

20、,瘧原蟲基本構造為 細胞質（胞漿）、核和瘧色素。 1.細胞漿 被染成蔚藍色或深藍色，隨著蟲體發(fā)育長大，細胞漿逐漸增多。間日瘧原蟲發(fā)育到大滋養(yǎng)體階段，胞漿呈阿米巴樣活動，胞漿內有空泡。,2. 核 即細胞核或染色質粒。在正常情況下核呈鮮紅色，呈圓形或不規(guī)則的顆粒狀。核的結構致密，只有在個別發(fā)育階段較為疏松，例如間日瘧原蟲雄配子體的核。有時因胞漿厚密或染色深藍，使核呈暗紅或紫紅色。3. 瘧色素

21、不著色，顏色和顆粒的形狀，因瘧原蟲種類而異。間日瘧原蟲的色素顆粒呈短棒狀，黃褐色；惡性瘧原蟲的色素顆粒呈細砂狀，黑褐色；三日瘧原蟲的色素呈砂粒狀，深褐色；卵形瘧原蟲的色素與間日瘧原蟲相似。瘧色素在蟲體內散在分布或聚集成團塊。,4. 被寄生的紅細胞 被間日瘧原蟲寄生的紅細胞脹大、顏色變淡。瘧原蟲發(fā)育至阿米巴樣體，紅細胞出現薛氏點。 被惡性瘧原蟲寄生的紅細胞大小正?；蛏晕⒖s小，紅細胞上有時見到茂氏點。 被三日瘧原蟲寄生的紅細胞大小正

22、常，紅細胞上可見到齊氏點。 被卵形瘧原蟲寄生的紅細胞稍脹大或不脹大，呈卵形或一端呈傘矢狀，薛氏點出現較早，于環(huán)狀體階段便可查見。,,,,,,瘧原蟲薄血膜形態(tài)鑒別,（吉氏染色）,,,間日瘧小滋養(yǎng)體--環(huán)狀體,較大，約占寄生紅細胞的1/3，胞漿較薄，一個核，很少見到一個紅細胞寄生2個環(huán)狀體和一個環(huán)狀體有2個核。,間日瘧滋養(yǎng)體-大滋養(yǎng)體,經8～10小時，蟲體增大，胞質增多，伸出偽足，阿米巴樣，常含空泡。出現黃褐色的瘧色素，細小、桿狀，散

23、在分布。紅細胞脹大，變形，顏色變淡，并出現數量較多，淡紅色的小點，稱薛氏小點,,間日瘧-裂殖體,,未成熟裂殖體經40小時晚期滋養(yǎng)體發(fā)育成熟，蟲體變圓，空泡消失，核分成2個以上。核開始分裂又稱裂殖體前期色素聚集成團塊,間日瘧成熟裂殖體,成熟裂殖子約有12－24個，通常16個，排列不規(guī)則。受染RBC 脹大、顏色蒼白、蟲體幾乎充滿紅細胞瘧色素集中成堆，常聚集一側。,配子體,瘧原蟲經過幾次紅細胞內裂體增殖，部分裂殖子在紅細胞內不

24、再進行裂體增殖，而發(fā)育為雌性配子體或雄性配子體，間日瘧原蟲配子體呈圓形或橢圓形，瘧色素均勻分布于蟲體內，核1個。,間日瘧原蟲雌配子體,蟲體較大，占滿脹大的紅細胞胞質致密，色深藍核小致密，深紅色，多位于蟲體一側瘧色素黃褐色，均勻散在,,間日瘧原蟲雄配子體,蟲體較小，圓形，占滿脹大的紅細胞胞質淺藍核大疏松，淡紅色，多位于蟲體的中央。瘧色素黃褐色，均勻散在,惡性瘧原蟲--環(huán)狀體,環(huán)纖細,約為RBC直徑的1/6，RBC不脹大，顏色稍

25、紫或正常核1個或2個，紅細胞常含2個以上原蟲蟲體常位于紅細胞的邊緣 ，呈“鳥飛狀”不帶色素,惡性瘧原蟲—大滋養(yǎng)體,一般不出現在外周血蟲體小結實，圓形，空泡不顯著，不活動瘧色素集中一團，黑褐色原蟲此時開始集中在內臟毛細血管,惡性瘧成熟裂殖體,裂殖子8～26個，通常8～18個，排列不規(guī)則瘧色素集中成一團，黑褐色蟲體占紅細胞體積的2/3至3/4,惡性瘧原蟲雌配子體,新月形，兩端較尖核1個，較小，致密，深紅色，常位于中央胞漿

26、深藍色瘧色素黑褐色，緊密分布于核周圍,惡性瘧原蟲雄配子體,臘腸形，兩端鈍圓胞漿淺藍或談紅色核1個，較大，疏松，淡紅色，位于中央瘧色素黑褐色，小桿狀，在核周圍松散分布,惡性瘧原蟲由于在發(fā)作間歇期，絕大部分瘧原蟲要進入內臟毛細血管發(fā)育，周圍血液內僅能發(fā)現環(huán)狀體和配子體。因此，惡性瘧在發(fā)作期為最適宜的查血時間。 如在血膜上查見許多這樣的小滋養(yǎng)體而無大滋養(yǎng)體，可判定為惡性瘧原蟲。惡性瘧原蟲粗大環(huán)狀體與間日瘧原蟲的環(huán)狀體相似，較難區(qū)別。

27、此時應依據血膜上有無其他發(fā)育階段的瘧原蟲來確定。 如果血膜上只有少數環(huán)狀體，其形態(tài)又不太典型，則應另外取血檢查，不應輕易下結論。,三日瘧原蟲主要形態(tài)特征,1. 寄生的紅細胞正常或縮小，有淡紅色細小的齊氏點2.環(huán)狀體中等大小，核較大，胞漿粗厚；3.滋養(yǎng)體胞漿常呈帶狀，核呈條狀，瘧色素深褐色，粗大常沿邊緣分布；4.裂殖體小于正常紅細胞，核6～12個，常排列成菊花狀，瘧色素常聚集于中央；5.雌雄配子體小于正常紅細胞，色素呈深褐色

28、；6.?？刹橐姼麟A段的瘧原蟲。,卵形瘧原蟲的主要形態(tài)特征,1. 寄生的紅細胞正常或稍脹大，可呈卵圓形或邊緣呈鋸齒（傘矢）狀，薛氏點出現較早粗大，量多； 2. 環(huán)狀體中等大小，核較大，胞漿粗厚； 3. 滋養(yǎng)體胞漿常呈圓形，空泡不明顯，瘧色素棕黃色，，粗大常沿邊緣分布； 4. 裂殖體小于正常紅細胞，核6～12個，常排列不規(guī)則，瘧色素常散在。 5. 雌雄配子體小于正常紅細胞，色素呈深褐色； 6. 常可查見各階段的瘧原蟲。,薄血膜4

29、種瘧原蟲形態(tài),,厚血膜4種瘧原蟲形態(tài),厚、薄血膜的優(yōu)缺點及其適用范圍 薄血膜 用血量約為2μl，涂制成2cm寬×4cm長面積的薄血膜。由于在制備過程中，血片通常經甲醇固定，使紅細胞及其內瘧原蟲的形態(tài)保持完整，便于瘧原蟲蟲種的鑒定。惟由于用血量少，為保證檢測的敏感性，常耗時較多，似不適用于大規(guī)模調查。即使在醫(yī)院的化驗室，由于要求在短時間內作出診斷，因而極有可能出現漏診。,厚血膜用血量約為4μl。涂制成直

30、徑1cm的厚血膜由于在制備過程中紅細胞已溶解，瘧原蟲在形態(tài)上仍可分辨，但胞漿和胞核不可避免地形成一定程度的固縮。受影響較大的有大滋養(yǎng)體、裂殖體的形態(tài)。在鏡檢厚血膜時，一般門診須檢查200~1000個油鏡視野（相當于0.5~2.5μl血量），才能確保鏡檢的敏感性和可重復性。通常的敏感性可達約10~20個原蟲/μl血。由于厚血膜與薄血膜相比血量大，須查范圍小，節(jié)省時間，陽性檢出率較高。厚血膜能查出瘧原蟲數是薄血膜的15～25倍。所以，我