中山大學(xué)病毒學(xué)研究方法

1、,病毒學(xué)研究方法,病毒培養(yǎng)方法形態(tài)學(xué)研究方法免疫學(xué)(血清學(xué))方法生化、生物物理與分子生物學(xué)方法,1、體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)二十世紀(jì)中期動物細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)的建立，極大推動了動物病毒學(xué)研究的發(fā)展原代成纖維細(xì)胞建株成纖維細(xì)胞上皮細(xì)胞,原代成纖維細(xì)胞 建株成纖維細(xì)胞 上皮細(xì)胞,Pig kidney cells (IBR-S2) growing on Cytodex 1.,Vero cells growi

2、ng on Cytodex 1.,人二倍體細(xì)胞培養(yǎng),接種細(xì)胞24小時,接種細(xì)胞72小時,收毒第3天,,,,,,MDCK細(xì)胞,Vero細(xì)胞培養(yǎng),接種細(xì)胞24小時,接種細(xì)胞48小時,接種細(xì)胞60小時,Vero細(xì)胞接種PEDV病毒病變過程照片,Vero細(xì)胞培養(yǎng),ST細(xì)胞,接種細(xì)胞24小時,接種細(xì)胞48小時,ST細(xì)胞,接種偽狂犬病毒病變過程照片,Marc-145 細(xì)胞,接種細(xì)胞24小時,接種細(xì)胞38小時,接種細(xì)胞50小時,Marc-145 細(xì)胞

3、,接種PRRSV病毒病變過程照片,PK-15 細(xì)胞,接種細(xì)胞24小時,接種細(xì)胞36小時,接種細(xì)胞48小時,PK-15 細(xì)胞,接種TGEV病毒病變過程照片,MDCK 細(xì)胞,接種細(xì)胞24小時,接種細(xì)胞48小時,接種細(xì)胞72小時,MDCK 細(xì)胞,接種H9N2病毒病變過程照片,細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在病毒學(xué)中的應(yīng)用病毒生物學(xué)定量病毒克隆化——獲得遺傳均一的病毒方便地生產(chǎn)病毒同步化研究病毒復(fù)制的過程，提高實驗的可重復(fù)性,病毒的定量并非所有的病毒顆粒

4、都有感染活性有感染活性的病毒顆粒一般僅占總數(shù)的幾 百到幾萬分之一,病毒的定量病毒的定量分為：物理顆粒的數(shù)量有感染活性的顆粒的數(shù)量有感染活性的顆粒的數(shù)量，更有生物學(xué)意義特稱為或Titre)病毒的效價 (Titer Titre,病毒效價的測定（之一） 空斑測試（plaque assay）用稀釋的病毒液感染單層細(xì)胞，蓋上瓊脂，限制病毒的流動病毒感染造成局部細(xì)胞死亡或病變，形成肉眼可見的“斑”或“空斑”（噬菌體中：噬菌斑）根據(jù)

5、“斑”的數(shù)量和稀釋倍數(shù)可以統(tǒng)計病毒的效價,病毒空斑,未感染的細(xì)胞被染成紅色,病毒空斑,顯微鏡下的空斑 帶有LacZ基因的重組病毒形成的空斑,病毒效價的測定（ 多孔板終點稀釋法）病毒逐級稀釋接入長有細(xì)胞的孔中，培養(yǎng)后觀察各孔中細(xì)胞是否被感染，計算TCID50 （Tissue Culture 50% Infection Dose ——一半的孔被感染時的稀釋度

6、）,病毒效價的相對性用不同的細(xì)胞株去測定病毒的效價，可能會得到完全不同的效價數(shù)據(jù)需要標(biāo)準(zhǔn)化,病毒感染復(fù)數(shù)(Multiplicity of Infection, MOI),病毒感染復(fù)數(shù)：病毒感染細(xì)胞時平均每個細(xì)胞的病毒數(shù),1萬個細(xì)胞，為了保證99%細(xì)胞感染病毒，至少有一個病毒感染，共需要多少病毒？病毒感染細(xì)胞是隨機(jī)的獨(dú)立事件? 群體感染時，有的細(xì)胞被1個病毒粒子感染，有的被2個病毒粒子感染……有的可能沒有被病毒感染? 病毒感

7、染細(xì)胞的情況，符合泊松分布：p(k)=e-mmk/k!(其中m：病毒感染復(fù)數(shù)，p(k)：細(xì)胞被k個病毒感染的幾率)所以：未被感染的細(xì)胞的比率： p(0)= e-m被1個病毒感染的細(xì)胞比率：p(1)= e-mm被2個病毒感染的細(xì)胞比率：p(2)= e-mm 2 /2,,問題：pfu與TCID50 間的換算關(guān)系是：1TCID50 =0.7pfu為什么？,感染復(fù)數(shù)對病毒感染的實驗結(jié)果有很大影響低感染復(fù)數(shù)時感染不同步高感染復(fù)數(shù)

8、時病毒易產(chǎn)生變異? 不同的實驗要求不同的感染復(fù)數(shù),2、活體培養(yǎng)方法仍有許多病毒缺乏可供其復(fù)制的離體細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)如：乙肝病毒，大多數(shù)植物病毒活體系統(tǒng)還可提供病毒與宿主相互作用的信息免疫反應(yīng)致病機(jī)理治療方法最常用活體系統(tǒng)之一：雞胚,雞胚用于繁殖病毒、制備疫苗,雞胚的構(gòu)造和病毒培養(yǎng),流感病毒,單純皰疹病毒,病毒在雞胚中的繁殖流感病毒單純皰疹病,活體培養(yǎng)方法免疫缺陷動物(SCID 小鼠）對病毒感染無免疫排斥可接入人的免疫細(xì)

9、胞等，使之具有人的免疫功能，用于研究 HIV、皰疹病毒等與免疫系統(tǒng)的相互關(guān)系SCID：severe combined immunodeficient,二、病毒形態(tài)學(xué)研究方法1、光學(xué)顯微鏡病毒細(xì)小，一般光學(xué)顯微鏡下不可見但有時可見病毒聚集，或衍生形成的包涵體,狂犬病毒包涵體,病毒包含體,昆蟲桿狀病毒的多角體,2、電子顯微鏡,噬菌體負(fù)染，透射電鏡 皰疹病毒感染細(xì)胞的超薄切片，透射電鏡,新的

10、電鏡技術(shù)冰凍電鏡低輻射電鏡,冰凍電鏡圖像重構(gòu)技術(shù),冰凍電鏡解析病毒結(jié)構(gòu),一種綠藻病毒的冰凍電鏡重構(gòu),冰凍電鏡解析病毒結(jié)構(gòu),質(zhì)型多角體病毒冰凍電鏡圖,X射線晶體學(xué)通過X射線衍射研究病毒中原子、分子的排列,研究可形成晶體的病毒,熒光顯微鏡,新的熒光顯微鏡技術(shù)用于實時跟蹤AAV 入侵的過程,三、免疫學(xué)方法病毒學(xué)與免疫學(xué)是密切相關(guān)的免疫技術(shù)在病毒學(xué)中的應(yīng)用——利用抗原抗體反應(yīng)的專一性進(jìn)行：病毒的檢測病毒的鑒定分型病毒的定量特異性

11、抗體的監(jiān)測,常用免疫學(xué)技術(shù)血球凝集試驗補(bǔ)體結(jié)合試驗酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）免疫印跡試驗（Western blot）免疫熒光組織化學(xué)免疫膠體金標(biāo)記免疫共沉淀,血球凝集試驗?zāi)承┎《揪哂信c血細(xì)胞表面多糖分子結(jié)合的蛋白（基團(tuán)）。如流感病毒，風(fēng)疹病毒,補(bǔ)體結(jié)合試驗游離的補(bǔ)體可導(dǎo)致抗體包被的紅血球破裂(溶血)但當(dāng)有抗原-抗體復(fù)合物存在時，補(bǔ)體就會與抗原-抗體復(fù)合物結(jié)合，可避免溶血。由此可檢測是否有特定的抗原或抗體存在,補(bǔ)

12、體結(jié)合試驗：測定特定抗原的量抗體（抗血清）與待測抗原樣品混合 加入一定量的補(bǔ)體 加入包被抗體的紅血球 測定溶血,酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）用酶標(biāo)記的抗體靈敏地定量檢測病毒抗原,ELISA: Enzyme linked Immuno-Sorbent AssayA 雙抗夾心B 間接法,ELISA檢測抗體,A：抗原E：標(biāo)記酶S：低物,四、生化、生物物理與分子生物學(xué)方法生物物理方