基因工程復(fù)習(xí)知識(shí)點(diǎn) 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)

1、基因工程知識(shí)點(diǎn)總結(jié)代課老師尹俊10級(jí)生計(jì)2左俊整理1《基因工程》復(fù)習(xí)參考《基因工程》復(fù)習(xí)參考知識(shí)點(diǎn)總結(jié)知識(shí)點(diǎn)總結(jié)代課教師：尹俊代課教師：尹俊整理：左俊整理：左俊說(shuō)明：說(shuō)明：內(nèi)容來(lái)源：網(wǎng)絡(luò)，筆記，教材和個(gè)人理解。個(gè)人整理錯(cuò)誤或者理解有誤的地方，請(qǐng)自行改正，本○1人整理內(nèi)容僅供參考。時(shí)間有限，整理倉(cāng)促，資料有限，導(dǎo)致內(nèi)容詳略不一，請(qǐng)參考老師給的重點(diǎn)，添加缺少的內(nèi)容，○2較詳細(xì)啰嗦的內(nèi)容可選擇性參考。內(nèi)容前后安排大致和老師所講的順序以及教材保

2、持順序一致。○3緒論（內(nèi)容略）緒論（內(nèi)容略）基因工程基本技術(shù)基因工程基本技術(shù)分子雜交分子雜交分子雜交（分子雜交（hybridization):有一定同源性的兩條核酸單鏈，在適宜的溫度和離子濃度等條件下，通過(guò)堿基互補(bǔ)退火形成穩(wěn)定的雙鏈分子的過(guò)程。Southern雜交：雜交：DNA片段經(jīng)電泳分離后，從凝膠中轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜或尼龍膜上，然后與探針雜交進(jìn)行檢測(cè)。被檢對(duì)象為DNA，探針為DNA或RNA。Nthern雜交：雜交：RNA片段經(jīng)電泳

3、后，從凝膠中轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上或尼龍膜，然后用探針雜交進(jìn)行檢測(cè)。被檢對(duì)象為RNA探針為DNA或RNA。Western印跡法：印跡法：檢測(cè)蛋白質(zhì)，即將電泳分離的非標(biāo)記蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固相載體上，用特異的抗血清對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定及定量的方法Southern雜交可用來(lái)檢測(cè)經(jīng)限制性內(nèi)切酶切割后的DNA片段中是否存在與探針同源的序列，它包括下列步驟:(1)DNA提取(2)酶切DNA(3)凝膠電泳分離各酶切片段(4)使DNA原位變性(5)轉(zhuǎn)膜(6)預(yù)

4、雜交濾膜掩蓋濾膜上非特異性位點(diǎn)(7)探針與DNA雜交(8)通過(guò)放射自顯影檢查目的DNANthern雜交步驟：雜交步驟：(1)取表達(dá)目的基因的組織樣品(2)總RNA提取(3)分離mRNA(4)RNA電泳(5)轉(zhuǎn)膜(6)預(yù)雜交(7)探針雜交(8)放射自顯影原位雜交原位雜交基因工程知識(shí)點(diǎn)總結(jié)代課老師尹俊10級(jí)生計(jì)2左俊整理3TA克?。嚎寺。豪肞CR反應(yīng)中所使用的聚合酶具有在3′加上A的末端轉(zhuǎn)移的活性，使PCR產(chǎn)物與一個(gè)具有3′T突出的載體D

5、NA連接起來(lái)的方法DNA測(cè)序方法測(cè)序方法Sanger雙脫氧鏈終止法原理雙脫氧鏈終止法原理：在模板指導(dǎo)下，聚合酶不斷將dNTP加到引物的3’OH末端，使引物延長(zhǎng)，合成出新的互補(bǔ)的DNA鏈，如果加入雙脫氧三磷酸核苷(ddNTP）由于雙脫氧核糖的3’位置上缺少一個(gè)羥基，故不能同后續(xù)的dNTP形成磷酸二酯鍵，即形成一種全部具有相同5’引物端和以ddNMP殘基為3’端結(jié)尾的一系列長(zhǎng)短不一片段的混合物。采用聚丙烯酰胺凝膠電泳區(qū)分長(zhǎng)度差一個(gè)核苷酸的單

6、鏈DNA，從而讀取DNA的核苷酸序列?；蚬こ坦ぞ呙富蚬こ坦ぞ呙窪NA聚合酶聚合酶（1）大腸桿菌）大腸桿菌DNA聚合酶聚合酶I?基本性質(zhì)：5’→3’的DNA聚合酶活性5’→3’的核酸外切酶活性；3’→5’的核酸外切酶活性。?基本用途：缺口前移：Nicktranslation（切口平移）；制備P標(biāo)記的探針。（2）Klenowfragment①Klenowfragment的性質(zhì)：具有5’→3’的DNA聚合酶活性和3’→5’的核酸外切酶活性

7、。（失去了5’→3’外切酶活性）。②基本用途?末端補(bǔ)齊（補(bǔ)平5′突出末端，切除3′突出末端）?DNA3’末端標(biāo)記（在3’隱蔽端加上放射性標(biāo)記的dNTP）?在cDNA克隆中，用于cDNA第二鏈的合成。?雙脫氧末端終止法測(cè)定DNA序列（3）T4DNA聚合酶聚合酶①基本特性：a.具有5’→3’的DNA聚合酶活性和3’→5’的核酸外切酶活性。b.在無(wú)dNTP時(shí)，可以從任何3‘OH端外切c.在只有一種dNTP時(shí)，外切至互補(bǔ)核苷酸暴露時(shí)停止d.在有

8、四種dNTP均存在時(shí)，聚合活性占主導(dǎo)地位。②基本用途a.補(bǔ)平隱蔽末端；b.DNA3’末端標(biāo)記（4）T7DNA聚合酶聚合酶②T7DNA聚合酶的特點(diǎn)：?持續(xù)合成能力強(qiáng)：一旦與模板結(jié)合就會(huì)不間斷地合成互補(bǔ)鏈。?3’→5’外切酶活性高：?jiǎn)捂満碗p鏈都能降解。?不受DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響③T7DNA聚合酶的用途?以大分子量DNA為模板的合成：如M13?進(jìn)行末端標(biāo)記：與T4DNA聚合酶相同?補(bǔ)平隱蔽末端：合成補(bǔ)平3’隱蔽末端；水解修平3’突出末端。（5