內(nèi)蒙古大學(xué)基因工程大實(shí)驗(yàn)思考題

1、 本科生基因工程實(shí)驗(yàn)(記錄及課后思考題)姓名:學(xué)號(hào):專業(yè):完成日期:2012 年 9 月 9 日指導(dǎo)老師:2. 引物序列是根據(jù)什么設(shè)計(jì)的？為什么要加上酶切位點(diǎn)序列？根據(jù) cDNA 設(shè)計(jì)引物，為了更好地與載體連接。 3. 為什么要在最后延伸 10min？一般在擴(kuò)增反應(yīng)完成后,都需要一步較長(zhǎng)時(shí)間(10-30min)的延伸反應(yīng),以獲得盡可能完整的產(chǎn)物。 4. 實(shí)驗(yàn)中是否有非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物或引物二聚體帶？如何才能

2、消除？有①.重新設(shè)計(jì)引物②加大模板用量或減少引物用量③擴(kuò)大反應(yīng)體系 ④提高退火溫度或 Mg 離子濃度五、從瓊脂糖凝膠中回收 五、從瓊脂糖凝膠中回收 DNA DNA 片段 片段1.為何避免用 EB 染色及用紫外燈照射欲回收的目的 DNA？紫外照射對(duì) DNA 有損傷， ，為了保證 DNA 的完整性，盡量不用 EB 染色或紫外照射。六、目的基因片段與載體連接 六、目的基因片段與載體連接1．連接酶的最適活性溫度是多少？37℃2．為什么要采用 1

3、4℃下連接？由于熱穩(wěn)定性較差，因此長(zhǎng)時(shí)間反應(yīng)時(shí)通常需在 14°C 下進(jìn)行3．如何確定插入片段的用量與質(zhì)粒載體的用量？一般參考 T4 連接酶的說(shuō)明書，大多數(shù)人做的是插入片段：載體=3：1 至5：1，是分子數(shù)的比值?？梢韵葴y(cè)出兩者的質(zhì)量濃度（分光光度計(jì)或者跑電泳） ，然后根據(jù)分子量大小可以算出。七、感受態(tài)大腸桿菌的制備 七、感受態(tài)大腸桿菌的制備1. 制作感受態(tài)菌的過(guò)程中，應(yīng)注意哪些關(guān)鍵步驟？①操作是防止污染，這個(gè)最容易影響感受態(tài)制

4、作的因素。②懸浮沉淀的過(guò)程，一定要輕輕懸浮，最好輕搖懸浮。2. CaCl2 溶液的作用是什么？為什么要冰冷的？作用：懸浮菌體 在 0～4℃，CaCl2 低滲溶液中，細(xì)胞膨脹成球狀，轉(zhuǎn)化混合物中的 DNA 形成抗 DNA 酶的羥基－鈣磷酸復(fù)合物黏附于細(xì)胞表面，較低的溫度也降低了相關(guān) 酶的活性較好的保存了 DNA，冰浴過(guò)程中，原來(lái)加在溶液中的鈣離子和細(xì)菌細(xì) 胞膜結(jié)合，在低溫下形成液晶結(jié)構(gòu)，這樣，在 42 度熱激下，這種液晶結(jié)構(gòu)收縮，將細(xì)胞膜

5、扯開孔道，使 DNA 進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞中。八、感受態(tài)細(xì)菌的轉(zhuǎn)化 八、感受態(tài)細(xì)菌的轉(zhuǎn)化1.影響轉(zhuǎn)化效率的因素有哪些？①細(xì)菌的生長(zhǎng)狀態(tài)：實(shí)驗(yàn)中應(yīng)密切注視細(xì)菌的生長(zhǎng)狀態(tài)和密度，盡量使用對(duì)數(shù) 生長(zhǎng)期的細(xì) 胞 （一般通過(guò)檢測(cè) OD600 來(lái)控制。 DH5α菌株 OD600 為 0.5 時(shí)細(xì)胞密度是 5×107/ml）； ②所有操作均應(yīng)在無(wú)菌條件和冰上進(jìn)行； ③經(jīng) CaCl2 處理的細(xì)胞，在低溫條件下，一定的時(shí)間內(nèi)轉(zhuǎn)化率