sds-page凝膠電泳操作

1、SDSPAGE凝膠電泳操作一、常規(guī)試劑的配制一、常規(guī)試劑的配制1.30%聚丙烯酰胺貯液聚丙烯酰胺貯液：丙烯酰胺150g，甲叉雙丙烯酰胺4g，雙蒸水500ml，濾紙過濾后，棕色瓶避光4℃保存；2.1.5molL，pH8.8TrisHCl分離膠緩沖液分離膠緩沖液：18.15gTris，用1molLHCl定容至100ml，棕色瓶避光4℃保存；3.1.0molL，pH6.8TrisHCl分離膠緩沖液分離膠緩沖液：12gTris，用1molL調(diào)p

2、H至100ml，棕色瓶避光4℃保存；4.10%SDS溶液溶液：10gSDS加水定容至100ml，完全溶解室溫保存；5.10%AP溶液溶液：0.1gAP（過硫酸銨）加水定容至1ml，用前新鮮配制；6.1SDSPAGE電泳緩沖液電泳緩沖液：25mMTris（3.0285gL），192mM甘氨酸（14.41gL），0.1%SDS（1gL），pH8.30；7.染色液染色液：0.25g考馬斯亮藍R250溶解于45ml甲醇，45ml水，10ml冰醋

3、酸，過濾除去雜質(zhì)；8.脫色液脫色液：45ml甲醇，45ml水，10ml冰醋酸；9.固定液固定液：50ml甲醇，40ml水，10ml冰醋酸；10.2SDSPAGE上樣緩沖液上樣緩沖液：10%SDS0.4ml，0.375MTrisHCl（pH6.8）0.333ml，甘油0.2ml，1%溴酚蘭10μL，β疏基乙醇100μL，加水定容至1ml，分裝后20℃保存。二、樣品的處理二、樣品的處理1.蛋白含量較低的酶制劑或原料樣品（1）粉劑（或顆粒）樣

4、品稱取樣品1g，加入35ml蒸餾水進行攪拌溶解1h（攪拌時間可根據(jù)實際情況進行增減），4000rpm離心10min，取離心上清液等體積加入20%的三氯乙酸聚沉30min，離心，棄去離心上清液，用70%的丙酮溶液洗滌沉淀，4000rpm離心10min，重復(fù)洗滌35次，將丙酮洗滌液吹干，加入適量（13ml）PBS溶解沉淀，溶解液即可用于電泳實驗。（2）液體樣品液體樣品經(jīng)離心后，取離心上清液等體積加入20%的三氯乙酸聚沉30min，離心，棄去

5、離心上清液，用70%的丙酮溶液洗滌沉淀，4000rpm離心10min，重復(fù)洗滌35次，將丙酮洗滌液吹干，加入適量（13ml）PBS溶解沉淀，溶解液即可用于電泳實驗。2.蛋白含量相對較高的酶制劑或原料樣品（1）粉劑（或顆粒）樣品速進行注膠，注膠過程要平穩(wěn)，避免產(chǎn)生氣泡，注膠完成后用蒸餾水進行水封（水封的目的是為了使分離膠上延平直，并排除氣泡，且防止氧化），凝膠聚合好的標(biāo)志是膠與水層之間形成清晰的界面。3.濃縮膠的制備分離膠制備完成后，靜置

6、6090min，確保分離膠凝結(jié)完全后，倒出水封液體并用濾紙把剩余的水分吸干，按下表進行SDSPAGE濃縮膠的配制。試劑濃度（5%）H2O（ml）4230%AcrBis（29:1）（ml）10.51.0molLTris.cl（pH8.8）（ml）10.510%SDS（μl）804010%AP（μl）6030TEMED（μl）84總體積（ml）63所有試劑加入燒杯中，充分混勻后，連續(xù)平穩(wěn)加入濃縮膠至離邊緣5mm處，迅速插入樣梳（樣梳需一次平

7、穩(wěn)插入，梳口處不得有氣泡，梳底需水平），靜置4060min。4.制樣吸取經(jīng)預(yù)處理后樣品25μl與25μl上樣緩沖液混合均勻后，于沸水煮35min去掉亞穩(wěn)態(tài)聚合，冷卻后4000rpm離心4min。5.上樣濃縮膠凝結(jié)后，向上槽內(nèi)倒入適量電泳緩沖液，拔出樣梳（要使鋸齒孔內(nèi)的氣泡全部排出，否則會影響加樣效果），向每孔內(nèi)加樣10μl（加樣時移液槍要始終豎直，且加樣迅速，為避免邊緣效應(yīng)，最好選取中部孔注樣）。6.跑膠加樣完成后，在電泳槽內(nèi)加入適量電