新型熒光探針的合成及其在SDS-PAGE上糖蛋白檢測(cè)技術(shù)的研究.pdf

1、目的:
　　1.基于席夫堿(PAS)的原理，合成了一系列具有熒光的酰肼類化合物。這些熒光化合物通過(guò)分子結(jié)構(gòu)上的肼基官能團(tuán)，可特異性地檢測(cè)混合蛋白中的糖蛋白。
　　2.在糖蛋白檢測(cè)領(lǐng)域現(xiàn)有的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步的提高檢測(cè)靈敏度，縮短檢測(cè)時(shí)間，降低檢測(cè)成本。開(kāi)發(fā)一種更加優(yōu)良、穩(wěn)定和實(shí)用的糖蛋白專屬檢測(cè)方法，更好地服務(wù)于糖蛋白組學(xué)領(lǐng)域的研究人員。
　　方法:
　　1.根據(jù)有機(jī)化學(xué)理論和文獻(xiàn)的指導(dǎo)，含醛基的化合物在常溫下極易與

2、含肼基的化合物發(fā)生反應(yīng)，生成相應(yīng)的腙、亞胺、酰胺脲等化合物。我們以含有苯環(huán)共軛的醛類為熒光母核，通過(guò)與含有兩個(gè)酰肼基的肼類化合物的一端酰肼基反應(yīng)得到目標(biāo)探針，再通過(guò)目標(biāo)探針的另一端酰肼基特異性地結(jié)合糖蛋白上氧化后的糖鏈，從而達(dá)到特異性地檢測(cè)糖蛋白的目的。在這一過(guò)程中，我們首先需要考察該探針的母核結(jié)構(gòu)與蛋白質(zhì)的有無(wú)特異性結(jié)合。如果沒(méi)有結(jié)合，說(shuō)明該探針不會(huì)通過(guò)其它結(jié)構(gòu)去結(jié)合蛋白質(zhì)，從而極有可能通過(guò)一端的酰肼基特異性地去檢測(cè)糖蛋白，因此可作為

3、備選的熒光探針。
　　2.在備選染料的熒光探針中，選取產(chǎn)率高、熒光強(qiáng)、毒性低、成本較低的熒光探針進(jìn)行下一步考察。
　　3.我們分別通過(guò)對(duì)混合的標(biāo)準(zhǔn)蛋白（同時(shí)含糖蛋白和非糖蛋白）以及分別從人血清、人成纖維細(xì)胞、小鼠心肌組織、小鼠肝臟組織提取的總蛋白樣品來(lái)共同考察這種新建立的糖蛋白檢測(cè)技術(shù)。
　　4.首先，樣品總蛋白經(jīng)過(guò)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳(SDS-PAGE)分離;分離后的凝膠置于一定比例的醇酸溶液中固定，用

4、于除去影響下一步氧化效率的殘留電泳液成分。
　　5.糖蛋白檢測(cè)大多數(shù)是根據(jù)經(jīng)典席夫堿的原理，首先加入氧化劑夠高效地將蛋白質(zhì)上糖基的鄰二羥基氧化成鄰二醛基，再與含氨基、肼基或腙基的熒光探針結(jié)合。我們選用了多種常用的氧化劑，然后根據(jù)實(shí)驗(yàn)的需求從中篩選出具有水溶性好、毒性較低、氧化效率高，作用溫和的氧化劑進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)，通過(guò)檢測(cè)結(jié)果確定最佳的氧化條件。
　　6.實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)殘留的氧化劑對(duì)檢測(cè)結(jié)果影響非常之大，為了去除殘留的氧化劑，

5、我們需要篩選一種有效的且不會(huì)影響后續(xù)檢測(cè)的還原劑。在選用的常用的還原劑中，根據(jù)實(shí)驗(yàn)的需求從中篩選出具有水溶性好、毒性較低、干擾少，進(jìn)一步通過(guò)檢測(cè)結(jié)果確定最佳的還原條件。
　　7.樣品處理完畢后，接著加入新合成的探針進(jìn)行染色。該過(guò)程仍需篩選探針的溶劑外環(huán)境、染色濃度、染色時(shí)間，最終確定其最佳著色條件。
　　8.經(jīng)熒光探針染色后的凝膠上的糖蛋白，需要置于凝膠成像儀內(nèi)成像，收集熒光信號(hào)。
　　9.最后，采用糖蛋白的去糖基化酶

6、(PNGase F)的去糖基化實(shí)驗(yàn)、凝集素富集實(shí)驗(yàn)、LC-MS/MS質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)，同時(shí)與其他使用的糖蛋白檢測(cè)試劑盒進(jìn)行對(duì)比，共同來(lái)考察這種新方法術(shù)的選擇性、靈敏度和有效性。
　　結(jié)果:
　　1.從一系列合成的酰肼類熒光探針中，發(fā)現(xiàn)1-芘基碳酰肼(UGF202)，其在熒光、成本和檢測(cè)特異性方面均優(yōu)于其他備選染料。
　　2.從雙氧水、高錳酸鉀、重鉻酸鉀、高碘酸(HIO4)等常用的氧化劑中，最終選擇了高碘酸作為氧化劑并篩選出了最

7、佳氧化條件。在室溫條件下，高碘酸以較低的濃度在20分鐘內(nèi)將糖蛋白上的糖鏈部分高效率地開(kāi)環(huán)氧化成鄰二醛基，又可避免過(guò)度氧化。
　　3.從常用的還原劑中，如硼酸氫鈉、亞硫酸氫鈉、抗壞血酸(VC)，確定了抗壞血酸作為最佳還原劑，其優(yōu)點(diǎn)在于僅需5分鐘即可中和凝膠上殘留的高碘酸，而不會(huì)影響下一步熒光探針跟糖蛋白質(zhì)的共價(jià)結(jié)合，又能通過(guò)抗壞血酸的顏色變化來(lái)判斷高碘酸的去除情況。
　　4.總結(jié)以上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，這種新建立的糖蛋白特異性檢測(cè)方法

8、的操作步驟如下:
　　(1)經(jīng)SDS-PAGE分離后，凝膠置于50％甲醇(MeOH)5％無(wú)水醋酸(HAc)的固定液中固定20分鐘;
　　(2)棄去固定液，加入1％高碘酸(HIO4)的水溶液氧化20分鐘;
　　(3)棄去氧化液，加入1％抗壞血酸(VC)水溶液還原5分鐘;
　　(4)棄去還原液，加入由0.001％ UGF202，5％氮氮二甲基甲酰胺(DMF)和40％乙醇(EtOH)組成的染色液，作用20分鐘;

9、　　(5)置于凝膠成像儀上成像。
　　5.基于SDS-PAGE凝膠上糖蛋白的熒光檢測(cè)，分別從靈敏度、選擇性、檢測(cè)時(shí)間以及檢測(cè)成本的角度等去比較新建立UGF202的檢測(cè)技術(shù)與Pro-QEmerald糖蛋白檢測(cè)試劑盒:結(jié)果發(fā)現(xiàn)UGF202的檢測(cè)靈敏度是Pro-QEmerald試劑盒的2-4倍，在檢測(cè)特異性方面也略優(yōu)于Pro-Q Emerald試劑盒，并且大幅度地縮短了檢測(cè)時(shí)間，提高了檢測(cè)效率。
　　6.聯(lián)合二向凝膠電泳分離技術(shù)和